Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng
Nghiên cứu chế độ xử lý tách protein ra khỏi vỏ đầu
Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme thủy phân dịch thịt đầu tôm của dịch thủy phân
Tối ƣu chế độ thủy phân để thu dịch có khả năng chống oxy hóa
Nghiên cứu xây dựng quy trình thu hồi sản phẩm chống oxy hóa
Bƣớc đầu thử nghiệm sản phẩm để hạn chế quá trình oxy hoá lipit
Thuyết minh:
Nguyên liệu đầu tôm đƣợc đƣa vào thí nghiệm đảm bảo còn tƣơi, không bị biến đen, biến đỏ hay có mùi lạ, không lẫn tạp chất.
Tiến hành xử lý tách protein ra khỏi vỏ đầu bằng cách tận dụng hệ enzyme protease có sẵn trong đầu tôm. Vì vậy, nguyên liệu đƣợc xử lý sơ bộ để tách sơ bộ phần thịt đầu ra khỏi vỏ đầu tôm bằng cách cho nguyên liệu tự thủy phân ở nhiệt độ 60oC, thời gian 3 giờ, tỷ lệ nguyên liệu/nƣớc (w/v) 1:0 và sử dụng lực cơ học (xay nhồi bằng máy xay sinh tố) để tách phần thịt ra khỏi vỏ. Phần xử lý tách protein ra khỏi vỏ đầu kế thừa kết quả đề tài nghiên cứu khoa học của sinh viên (SV2012-13-03): “Nghiên cứu thu hồi dịch thủy phân protein có khả năng
chống oxy hóa từ đầu tôm thẻ chân trắng .
Sau khi tự thủy phân phần dịch protein thu hồi đƣợc sử dụng để:
- Đánh giá ảnh hƣởng của loại enzyme đến khả năng chống oxy hóa của thủy phân protein khi thủy phân bắng các loại enzyme khác nhau: Alcalase, Pepsin, Flavourzyme, Protamex;
- Nghiên cứu chế độ thủy phân tối ƣu để thu dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học cao;
- Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa lipit của dịch thủy phân protein thu đƣợc;
- Đề xuất qui trình thu hồi dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học.
2.3.2.2. Ảnh hưởng của loại enzyme đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein
Trong quá trình thủy phân việc bổ sung loại enzyme ảnh hƣởng rất nhiều tới hiệu suất thu hồi protein và khả năng chống của dịch thủy phân thu đƣợc.
Vì vậy, việc lựa chọn enzyme thích hợp cần nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình hoạt động của mỗi loại enzyme cũng nhƣ điều kiện tối thích của enzyme đó. Từ đó, chọn ra loại enzyme có khả năng thủy phân tốt tạo dịch thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao và có điều kiện hoạt động phù hợp nhất cho quá trình thủy phân thu dịch.
Trong đó chỉ tiêu để đánh giá hiệu quả hoạt động của enzyme đã chọn là hiệu suất thủy phân và khả năng chống oxy hóa của dịch thông qua đánh giá khả năng khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử của dịch thu đƣợc.
Trong đó, khả năng chống oxy hóa của dịch đƣợc tính nhƣ sau:
Khả năng chống oxy hóa = Khả năng chống oxy hóa của mẫu nghiên cứu – Khả năng chống oxy hóa của mẫu đối chứng
Trong đó, mẫu đối chứng là mẫu đƣợc thủy phân ở cùng điều kiện nhƣng không bổ sung enzyme.
Cách tiến hành:
Bố trí thí nghiệm thủy phân với bốn enzyme Alcalase, Protamex, Pepsin, Flavourzyme:
- Cùng nồng độ enzyme 5% so với hàm lƣợng protein ở nguyên liệu đầu tôm, thời gian 2 giờ.
- Tại nhiệt độ và pH thích hợp của từng lợi enzyme khác nhau. Bố trí mẫu dối chứng (không bổ sung enzyme) cùng nhiệt độ, pH với các mẫu thí nghiệm.
Sau khi thủy phân xong (trong 2 giờ) thu dịch rồi đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của từng dịch thu đƣợc của từng loại enzyme khác nhau đem so sánh đánh giá để lựa chọn enzyme phù hợp nhất.
Điều kiện tiến hành cụ thể theo bố trí thí nghiệm hình 2.2, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Dịch thịt
Đầu tôm tƣơi
Tách thịt đầu ra khỏi vỏ đầu
Vỏ đầu tôm Sử dụng để sản xuất chitin chitosan Mẫu 7: Không bổ sung enzyme, nhiệt độ: 55oC, pH = 7 Mẫu 4: Không bổ sung enzyme, nhiệt độ: 60oC, pH = 8 Mẫu 2: Enzyme pepsin, nhiệt độ: 40oC, pH = 2 Mẫu 3: Enzyme alcalase, nhiệt độ: 60oC, pH = 8 Mẫu 5: Enzyme protamex, nhiệt độ: 55oC, pH = 7 Mẫu 6: Enzyme flavourzyme, nhiệt độ: 55oC, pH = 7 Mẫu 1: Không bổ sung enzyme, nhiệt độ: 40oC, pH = 2
Thủy phân trong 2 giờ
Cô quay chân không
(Nhiệt độ 46oC, thời gian 18 phút, áp suất 48 bar) Ly tâm lạnh 5000 vòng/phút ở 4o
C trong 15 phút
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định mức độ ảnh hƣởng của enzyme đến thủy phân và khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein
2.3.2.3. Nghiên cứu tối ưu chế độ thủy phân để thu dịch có khả năng chống oxy hóa
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí chế độ thủy phân để thu dịch có khả năng chống oxy
hóa
Thịt đầu tôm
Thủy phân với enzyme đƣợc lựa chọn Thời gian 2 - 10 giờ pH thích hợp Nhiệt độ thích hợp Nồng độ enzyme 0,05 - 0,3%
Thu dịch thủy phân
Ly tâm lạnh
Xác định khả năng khử DPPH và tổng năng lực khử của dịch
Ở công đoạn trƣớc đã nghiên cứu ảnh hƣởng của các loại enzyme tới hoạt tính chống oxy hóa của dịch thu đƣợc, dựa vào kết quả đó chọn enzyme cho dịch có hoạt tính cao nhất và phù hợp nhất với điều kiện thí nghiệm.
Tiến hành bố trí thí nghiệm tối ƣu hóa quá trình thủy phân protein của thịt đầu tôm với các yếu tố nhiệt độ, pH tối thích nhƣ đã nghiên cứu ở mục 2.3.2.2 ảnh hƣởng của loại enzyme đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein (theo hình 2.2) và thời gian, nồng độ enzyme để chọn đƣợc chế độ phù hợp nhất đối với hoạt động của enzyme đó nhằm tối ƣu hóa quá trình thủy phân protein.
Tiến hành các nghiên cứu thăm dò và tham khảo các nguồn tài liệu xác định đƣợc miền giá trị của các thông số nhƣ sau:
- Nhiệt độ (oC): tối thích của enzyme đƣợc lựa chọn. - pH: tối thích của enzyme đƣợc lựa chọn.
- Thời gian (giờ): 2 - 10 giờ.
- Tỷ lệ enzyme bổ sung (%): từ 0,05 - 0,3% so với hàm lƣợng protein của nguyên liệu.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ bảng 2.1 với hàm mục tiêu là nồng độ DPPH bị khử cao nhất.
Bảng 2.1. Ma trận bố trí thí nghiệm tối ƣu chế độ thủy phân để thu dịch có khả năng chống oxy hóa
Mã số thí
nghiệm pH Tỷ lệ enzyme bổ sung (%) Thời gian (giờ)
1 7 0,300 2 2 7 0,050 2 3 8 0,175 6 4 9 0,050 10 5 8 0,175 6 6 9 0,050 2 7 7 0,300 2 8 9 0,300 2 9 9 0,300 2 10 9 0,050 10 11 7 0,300 10 12 9 0,300 10 13 7 0,300 10 14 9 0,300 10 15 7 0,050 2 16 7 0,050 10 17 9 0,050 2 18 8 0,175 6 19 7 0,050 10 20 8 0,175 6
2.3.2.4. Ứng dụng thử nghiệm sản phẩm thủy phân thu được để hạn chế quá trình oxy hoá lipit
Sản phẩm có hoạt tính oxy hóa đƣợc thu hồi theo qui trình ở hình 2.4 và đƣợc dùng để thử nghiệm khả năng chống oxy hóa lipit theo sơ đồ bố trí thí nghiệm hình 2.5. Sơ đồ qui trình thu hồi dự kiến:
Hình 2.4. Sơ đồ qui trình thu hồi sản phẩm thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa
Đầu tôm tƣơi
Tiến hành thí nghiệm tách thịt đầu ra khỏi vỏ đầu
Vỏ đầu Thịt đầu Tận dụng để sản xuất chitin Bất hoạt enzyme Dịch thủy phân Ly tâm lạnh Sấy phun Thủy phân bằng enzyme phù hợp - Nhiệt độ 4oC - Thời gian 15 phút - Tốc độ 5000vòng/phút
Cô quay chân không - Nhiệt độ 46 o
C - Thời gian 18 phút - Áp suất 48bar
Các phƣơng pháp đánh giá khả chống oxy hóa đƣợc sử dụng để đánh giá ảnh hƣởng của loại enzyme tới khả năng chống oxy hóa của dịch đã sử dụng ở công đoạn trƣớc là phƣơng pháp phân tích tổng năng lực khử và đánh giá khả năng khả năng kiểm soát gốc tự do DPPH (2,2-Diphenyl-1-picryl hydrazyl) đã đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của loại enzyme đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein từ đó chọn đƣợc enzyme thích hợp và tiến hành tối ƣu chế độ thủy phân để thu dịch có khả năng chống oxy hóa. Thu đƣợc dịch tiến hành đánh giá thử nghiệm theo hình 2.5.
Bƣớc đầu thử nghiệm sản phẩm tiến hành đánh giá khả năng hạn chế sự oxy hóa lipit trên các sản phẩm cụ thể ở đây tiến hành đánh giá trên mẫu cơ thịt đỏ cá ngừ vì đây là sản phẩm rất dễ bị oxy hóa với tốc độ nhanh nên việc đánh giá khả chống oxy hóa của dịch sẽ dễ dàng và chính xác hơn.
Tiến hành đánh giá theo các phƣơng pháp:
- Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch qua các mô hình phản ứng Fenton. Tiến hành khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 3 mẫu: Mẫu chƣa ly tâm, ly tâm và sau khi ly tâm đem đi cô quay chân không trên mô hình phản ứng Fenton ở bƣớc sóng 520 nm.
- Phản ứng xác định khả năng chống oxy hóa của dịch sử dụng hệ Fe2+ và H2O2 để kích hoạt quá trình oxy hóa của cơ thịt đỏ cá ngừ.Tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng trên hệ Fe2+
và H2O2 để kích hoạt quá trình oxy hóa của cơ thịt đỏ cá ngừ ở các khoảng thời gian khác nhau: 0 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút ở bƣớc sóng 520 nm
- Xác định chỉ số oxy hóa (TBARS) theo phƣơng pháp Buege và Aust (1970) trên cơ thịt đỏ cá ngừ. Phƣơng pháp TBARS ta xác định đƣợc màu sắc
của các sản phẩm oxy lipit tạo ra (andehyt, xeton...) đƣợc bắt màu bởi dung dịch TBA đã nhạt đi khi có bổ sung chất chống oxy hóa vì các chất này đã hạn chế đƣợc quá trình oxy hóa lipit của thịt cá nên làm giảm sự tạo thành các sản phẩm của quá trình oxy hóa lipit.
Bố trí thí nghiệm bƣớc đầu thử nghiệm sản phẩm tiến hành đánh giá khả năng hạn chế sự oxy hóa lipit theo ba phƣơng pháp đánh giá nhƣ hình 2.5.
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm bƣớc đầu thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của sản phẩm dịch thủy phân từ đầu tôm
Nguyên liệu đầu tôm tƣơi
Thủy phân thu dịch
Thử nghiệm dựa trên mô hình phản ứng TBARS trên các hệ phản ứng khác nhau
Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch qua các mô hình phản ứng Fenton. Xác định chỉ số oxy hóa (TBARS) theo phƣơng pháp Buege và Aust (1970) trên cơ thịt đỏ cá ngừ. Phản ứng xác định khả năng chống oxy hóa của dịch sử dụng hệ Fe2+ và H2O2 để kích hoạt quá trình oxy hóa của cơ thịt đỏ cá ngừ.
2.3.3. Phƣơng pháp phân tích và xác định các chỉ tiêu
2.3.3.1. Xác định khả năng chống oxy hóa của dịch thu được bằng test DPPH
Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân bằng Protamex so với dịch thủy phân không bổ sung enzyme.
Xác định khả năng chống oxy hóa thông qua khả năng khử tự do DPPH (2,2-Diphenyl-1-picryl hydrazyl). Khả năng khử tự do DHHP đƣợc xác định dựa vào phƣơng pháp đã đƣợc Bao và cộng sự (2010) sử dụng để kiểm tra khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ nấm [16].
- Nguyên lí: dựa vào độ mất màu của gốc tự do DPPH khi có mặt dịch thủy phân. DPPH là gốc khử, có bản chất dễ bị oxy hóa, có màu tím đậm, khi có mặt chất chống oxy hóa, gốc tự do DPPH sẽ nhận điện tử chuyển thành phân tử DPPH và mất màu tím. Nhƣ vậy, chất có hoạt tính chống oxy hóa càng mạnh sẽ làm mất màu dung dịch gốc tự do DPPH càng mạnh.
- Cách tiến hành: 1 ml DPPH 0,2 mM (dung môi là cồn 96%) và 3 ml mẫu vào mỗi ống nghiệm, lắc đều và ủ trong tối ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút. Sau đó, đo mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 517 nm. So sánh mật độ quang với ống đựng mẫu trắng (chỉ có 1 ml thuốc thử và 3 ml H2O).
- Kết quả đƣợc tính theo công thức:
Trong đó:
DPPH (%): Khả năng kiểm soát gốc tự do DPPH Acontrol: mật độ quang của ống đựng mẫu trắng Amẫu: mật độ quang của ống có mẫu
DPPH (%) = Acontrol – Amẫu Acontrol
2.3.3.2. Xác định khả năng chống oxy hóa của dịch thu được bằng phương pháp tổng năng lực khử
Mô tả: Cho vào ống nghiệm 0,2 ml mẫu cần đo, tiếp đó cho 0,5 ml K3Fe(CN)6 1% bổ sung tiếp 0,8 ml dung dịch đệm (pH = 6,6) cho đủ 1,5 ml. Hỗn hợp đƣợc đem ủ ở 500
C trong 20 phút.
Sau đó ta bổ sung vào ống nghiệm 0,5 ml CCl3COOH 10%. Tiếp tục bổ sung từ từ 2 ml nƣớc cất và 0,4 ml FeCl3 0,1%. Tƣơng tự đo khử gốc tự do DPPH ta tiến hành làm mẫu đối chứng nhƣng không cho mẫu đo mà thay bằng dung dịch đệm. Khả năng khử của hỗn hợp đƣợc đo ở bƣớc sóng 700 nm sử dụng máy đo quang phổ UV-Vis.
2.3.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ Lipit/Myoglobin/H2O2
- Nguyên lý:
Trong hệ lipit/myoglobin/H2O2, phản ứng oxy hóa lipit bị kích hoạt bởi gốc tự do ferrylmyoglobin (ferrylMb) tạo thành từ phản ứng giữa metmyoglobin (metMb) và H2O2.
Sản phẩm oxy hóa lipit tạo thành phản ứng với acid thiobarbituric (TBARS) tạo thành màu đỏ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 535 nm.
Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipit nên cƣờng độ màu đỏ giảm đi. Dựa vào sự thay đổi cƣờng độ màu đỏ để đánh giá hoạt tính của chất chống oxy hóa.
- Dụng cụ, thiết bị:
o Quang phổ kế UV-VIS
o Ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy loại 20 ml o Bể ổn nhiệt có thể thay đổi nhiệt độ từ 30 - 100o
- Hóa chất: o Metmyoglobin o H2O2 o Tween 20 o Lipit o Acid thiobarbituric o KCl o H3PO4 o Butanol - Cách tiến hành:
Cho vào ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy 0,1 ml metmyoglobin 100 µM và 0,1 ml H2O2 100 µM. Lắc đều để phản ứng xảy ra trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó cho tiếp vào ống nghiệm 0,4 ml lipit, 0,2 ml chất chống oxy hóa và 0,2 ml tween 20. Đậy nắp ống nghiệm, trộn đều trên máy (votex) rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 1 giờ.
Lấy 0,2 ml hỗn hợp các chất phản ứng cho vào ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy khác và cho thêm vào 0,3 ml KCl 1,15%, 0,5 ml H3PO4 1%, 1 ml thiobarbituric (TBARS) 0,6%. Đậy nắp ống nghiệm, lắc đều rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 95o
C trong 45 phút.
Sau đó, làm nguội nhanh dƣới vòi nƣớc chảy đến nhiệt độ phòng và tiếp tục cho vào ống nghiệm 4 ml Butanol, lắc đều rồi để yên trong 10 phút. Tách lớp butanol màu đỏ bên trên đem đi đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 520 nm trên quang phổ kế UV - Vis.
Mẫu đối chứng đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣng thay 0,2 ml chất chống oxy hóa bằng 0,2 ml dung môi dùng để hòa tan chất chống oxy hóa.
- Tính kết quả:
Hoạt tính chống oxy hóa (%) = [(Ao – A)/Ao]*100 Ao: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng ở bƣớc sóng 520 nm
A: Độ hấp thụ của mẫu có chứa chất chống oxy hóa ở bƣớc sóng 520 nm
2.3.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên cơ thịt đỏ cá ngừ bằng hệ kích hoạt H2O2 và Fe2+
- Nguyên lý:
Trong hệ protein cơ thịt cá/ H2O2/ Fe2+, phản ứng oxy hóa lipit bị kích hoạt bỡi gốc tự do ferrylmyoglobin (ferrylMb) có trong cơ thịt đỏ cá ngừ tạo thành từ phản ứng giữa metmyoglobin (metMb) và H2O2. Sản phẩm oxy hóa lipit tạo thành phản ứng với acid thiobarbituric (TBARS) tạo thành màu đỏ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 520 nm. Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipit nên cƣờng độ màu đỏ giảm đi. Dựa vào sự thay đổi cƣờng độ màu đỏ để đánh giá hoạt tính của chất chống oxy hóa.
- Dụng cụ, thiết bị:
o Quang phổ kế UV - vis
o Ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy loại 20 ml