1.3.1. Giới thiệu chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa chất khác. Phản ứng oxy hóa là loại phản ứng hóa học trong đó electron đƣợc chuyển sang các chất oxy hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật. Chất chống oxy hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng. Để làm vậy ngƣời ta hay dùng các chất khử (nhƣ thiol hay polyphenol) làm chất chống oxy hóa [29].
Chất chống oxy hóa đƣợc định nghĩa là tất cả những chất mà khi ta bổ sung chúng với hàm lƣợng nhỏ vào những đối tƣợng dễ bị oxy hóa thì sẽ ngăn chặn đáng kể phản ứng oxy hóa xảy ra [27]. Những đối tƣợng dễ bị oxy hóa ở đây bao gồm thực phẩm, các tế bào sống, protein, lipit và cacbonhydrate, AND. Định nghĩa này nhấn mạnh hơn tầm quan trọng của các chất chống oxy hóa [28]. Các chất chống oxy hóa thƣờng đƣợc nhắc đến trong cơ thể sống và trong thực phẩm từ ß-carotene và metallothionein đến các histidine chứa dipeptide (carnosine, homo carnosi, anserine), acid phytic, taurine, bilirubin, ostrogen, creatinine, polyamine và melatonin. Trong thực vật, các chất chống oxy hóa là các phenol nhƣ là quercetin, carnosol, thymol, acid carnosic, hydroxytyrosol, tannins, catechins, rutin, morin, acid ellagic… [27].
Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa: Chất chống oxy hóa là chất dinh dƣỡng, có thể làm sạch các gốc tự do bằng cách đƣa lên một electron. Khi một phân tử gốc tự do nhận thêm một electron từ một phân tử chống oxy hóa, các gốc tự do trở nên ổn định và không còn khả năng gây hại.
Ngoài ra, chất chống oxy hóa còn giúp hạn chế sự phân hủy các hydroperoxide.
Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa 1.3.2. Phân loại các chất chống oxy hóa
Các chất chống oxy hóa đƣợc phân loại theo nhiều cách khác nhau tùy vào tính chất và ứng dụng của nó. Tuy nhiên trong thực tế hiện nay thƣờng phân loại các chất chống oxy hóa theo ba cách sau:
a. Dựa vào tính chất hóa học
Các chất chống oxy hóa đƣợc chia thành hai loại là tan trong nƣớc hoặc tan trong dầu:
- Các chất chống oxy hóa tan trong nƣớc nhƣ: vitamin C, beta-caroten… - Các chất chống oxy hóa tan trong dầu nhƣ: vitamin E, các hợp chất phenol nhƣ là quercetin, thymol, carnosol…
Các chất chống oxy hóa đƣợc chia các chất chống oxy hóa thành hai loại là:
- Các chất đƣợc tổng hợp trong cơ thể
- Các chất đƣợc đƣa vào cơ thể qua thức ăn và các loại thực phẩm bổ sung. c. Dựa vào nguồn gốc
Chất chống oxy hóa trong thực phẩm bao gồm hai nhóm chính:
- Chất chống oxy hóa tự nhiên: Nhóm vitamin (vitamin C, vitamin E), alkaloid, selen, polyphenol, carotenoid, peptide…
- Chất chống oxy hóa tổng hợp: BHT (butylated hydroxytoluen), BHA (butylate hydroxyanisole), TBHQ (tertbutyl hydroquinone)...
1.3.3. Khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân
Hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein đã đƣợc nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm và qua khảo sát đã thu đƣợc một số kết quả khả quan nhƣ sau:
Năm 2009, nhóm các nhà khoa học ngƣời Thái Lan đã nghiên cứu sản phẩm lên men của tôm và giáp xác, đây là các sản phẩm truyền thống của Thái Lan. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng sản phẩm lên men này có hàm lƣợng protein cao, và hầu hết các sản phẩm có hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả năng chống oxy hóa tự nhiên và có lợi ích cho sức khỏe.
Năm 2007, bằng các test thử về khả năng chống oxy hóa, một nhóm các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra chất chống oxy hóa có trong Mungoong, một món ăn truyền thống của ngƣời Thái Lan đƣợc làm từ dịch chiết từ phế liệu của tôm. Qua nghiên cứu, ngƣời ta nhận thấy rằng Mungoong chứa các chất chống oxy hóa. Dịch hòa tan từ sản phẩm này có hoạt tính chống oxy hóa cao bởi các
test thử DPPH, ABTS radical scavenging activities và FRAP. Hoạt tính chống oxy hóa phụ thuộc vào nồng độ dịch hòa tan từ sản phẩm này.
Thành phần của protein thủy phân gồm các peptide và các acid amin khi sự phân giải protein đƣợc gây ra bởi protease nội tại và enzyme bổ sung. Peptide là một chuỗi các acid amino tƣơng tự nhƣ protein nhƣng ngắn hơn. Peptide không kèm theo các hóa chất khác và đƣợc chiết xuất từ các amino acid có nguồn gốc tự nhiên. Loại peptide đầu tiên phải kể đến ở động vật có xƣơng sống là các peptide kháng thể trong máu, chúng là những yếu tố nhận biết đắc lực các tác nhân vi khuẩn, virus và các vật thể lạ xâm nhập vào cơ thể và để loại trừ chúng ra khỏi cơ thể. Ngoài ra, trong máu của động vật trên còn có các interferon với nồng độ nhỏ có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của virus.
Peptide từ thực phẩm đƣợc coi là hợp chất an toàn và có lợi cho sức khỏe, chúng có cấu trúc đơn giản, có nhiều tính chất ổn định. Chúng có giá trị dinh dƣỡng cao và nhiều chức năng sinh học nhƣ chống tăng huyết áp, điều hòa miễn dịch… [16], trong đó có chức năng chống oxy hóa. Có sự ức chế quá trình peroxide lipit, lọc sạch các gốc tự do và kiềm hãm sự chuyển đổi ion kim loại của các peptide chống oxy hóa. Khả năng chống oxy hóa của các peptide có liên quan tới kết cấu của chúng, cấu trúc và tính không ƣa nƣớc. Sự hiện diện ở vị trí thích hợp của các acid amin cấu thành các peptide trong chuỗi peptide giữ một vai trò quan trọng trong chức năng chống oxy hóa của peptide. Liên kết peptide phản ánh cấu trúc rõ ràng, cụ thể của peptide, đồng thời cũng đƣợc khẳng định là có ảnh hƣởng đến phạm vi chất chống oxy hóa của peptide. Khối lƣợng phân tử của peptide cũng ảnh hƣởng đến hoạt động chống oxy hóa, peptide có khối lƣợng phân tử trong khoảng 500 - 1500 Da là có hoạt động chống oxy hóa tốt nhất [5].
Gần đây đã có những nghiên cứu tƣơng đối nhiều protein cá thủy phân dựa trên toàn bộ cá, phi lê cá hoặc các bộ phận khác. Sản xuất dịch thủy phân protein từ cá nục tròn với các hoạt động chống oxy hóa tƣơng đối mạnh có thể mở một hƣớng mới để sử dụng toàn bộ tất cả các bộ phận của cá cũng nhƣ là có thể sử dụng mọi loài cá để tạo ra các sản phẩm giá trị gia tăng và đƣợc sử dụng nhƣ một chất chống oxy hóa để ngăn chặn quá trình oxy hóa lipit trong hệ thống thực phẩm.
1.3.4. Các phƣơng pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein phân protein
Hiện nay, có rất nhiều phƣơng pháp có thể sử dụng đánh giá khả năng chống oxy hóa đƣợc các nhà nghiên cứu khoa học áp dụng. Trong đó, có thể đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch bằng các phƣơng pháp nhƣ sau:
- Phƣơng pháp phân tích tổng năng lực khử theo phƣơng pháp Oyaizu (1986).
- Phƣơng pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch thủy thông qua khả năng kiểm soát gốc tự do DPPH (2,2-Diphenyl-1-picryl hydrazyl). Khả năng kiểm soát gốc tự do DHHP khả năng chống oxy hóa đƣợc xác định dựa vào phƣơng pháp đã đƣợc Bao và cộng sự (2010) sử dụng để kiểm tra khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ nấm [22].
- Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch qua các mô hình phản ứng Fenton.
- Phản ứng xác định khả năng chống oxy hóa của dịch sử dụng hệ Fe2+ và H2O2 để kích hoạt quá trình oxy hóa của cơ thịt đỏ cá ngừ.
- Xác định chỉ số oxy hóa (TBARS) theo phƣơng pháp Buege và Aust (1970) trên cơ thịt đỏ cá ngừ.
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu đầu tôm
Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) đƣợc chọn là đối tƣợng nghiên cứu. Nguyên liệu đầu tôm đƣợc mua tại cơ sở chế biến nhỏ chuyên cung cấp tôm tƣơi cho các trƣờng học ở chợ Xóm Mới - Nha Trang. Đầu tôm tƣơi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, biến đen, không lẫn tạp chất.
Nguyên liệu đầu tôm đƣợc thu mua ngay sau khi lặt đầu, cho vào bao PA và bảo quản lạnh trong thùng xốp cách nhiệt bằng nƣớc đá, nhiệt độ 4oC và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Thời gian bảo quản nguyên liệu tối đa 3 giờ.
2.1.2. Enzyme Protease
Enzyme Protamex: đƣợc mua tại công ty Novozyme, TP.HCM thu đƣợc
từ Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus licheniformis. Hoạt tính của chế phẩm
Protamex 1,5 UI/mg. Chế phẩm enzyme Protamex có nhiệt độ hoạt động tối ƣu là 55oC, pH hoạt động trung tính. Nhiệt độ bảo quản chế phẩm là 0 - 5o
C.
2.1.3. Hóa chất nghiên cứu
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết đƣợc dùng cho phân tích.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các loại enzyme xử lý đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân; hóa của dịch thủy phân;
2.2.2. Nghiên cứu chế độ thủy phân tối ƣu để thu dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học cao; tính sinh học cao;
2.2.3. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng chống oxy hóa lipit của dịch thủy phân protein thu đƣợc; protein thu đƣợc;
2.2.4. Đề xuất qui trình thu hồi dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 2.3.1. Phƣơng pháp thu nhận mẫu 2.3.1. Phƣơng pháp thu nhận mẫu
Nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng tƣơi (Penaeus vannamei) khi đƣợc vận chuyển về tới phòng thí nghiệm đƣợc loại bỏ sạch tạp chất, đảm bảo 100% là đầu tôm và đƣợc tiến hành làm thí nghiệm ngay.
2.3.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm đƣợc bố trí theo phƣơng pháp qui hoạch thực nghiệm.
2.3.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng
Nghiên cứu chế độ xử lý tách protein ra khỏi vỏ đầu
Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme thủy phân dịch thịt đầu tôm của dịch thủy phân
Tối ƣu chế độ thủy phân để thu dịch có khả năng chống oxy hóa
Nghiên cứu xây dựng quy trình thu hồi sản phẩm chống oxy hóa
Bƣớc đầu thử nghiệm sản phẩm để hạn chế quá trình oxy hoá lipit
Thuyết minh:
Nguyên liệu đầu tôm đƣợc đƣa vào thí nghiệm đảm bảo còn tƣơi, không bị biến đen, biến đỏ hay có mùi lạ, không lẫn tạp chất.
Tiến hành xử lý tách protein ra khỏi vỏ đầu bằng cách tận dụng hệ enzyme protease có sẵn trong đầu tôm. Vì vậy, nguyên liệu đƣợc xử lý sơ bộ để tách sơ bộ phần thịt đầu ra khỏi vỏ đầu tôm bằng cách cho nguyên liệu tự thủy phân ở nhiệt độ 60oC, thời gian 3 giờ, tỷ lệ nguyên liệu/nƣớc (w/v) 1:0 và sử dụng lực cơ học (xay nhồi bằng máy xay sinh tố) để tách phần thịt ra khỏi vỏ. Phần xử lý tách protein ra khỏi vỏ đầu kế thừa kết quả đề tài nghiên cứu khoa học của sinh viên (SV2012-13-03): “Nghiên cứu thu hồi dịch thủy phân protein có khả năng
chống oxy hóa từ đầu tôm thẻ chân trắng .
Sau khi tự thủy phân phần dịch protein thu hồi đƣợc sử dụng để:
- Đánh giá ảnh hƣởng của loại enzyme đến khả năng chống oxy hóa của thủy phân protein khi thủy phân bắng các loại enzyme khác nhau: Alcalase, Pepsin, Flavourzyme, Protamex;
- Nghiên cứu chế độ thủy phân tối ƣu để thu dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học cao;
- Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa lipit của dịch thủy phân protein thu đƣợc;
- Đề xuất qui trình thu hồi dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học.
2.3.2.2. Ảnh hưởng của loại enzyme đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein
Trong quá trình thủy phân việc bổ sung loại enzyme ảnh hƣởng rất nhiều tới hiệu suất thu hồi protein và khả năng chống của dịch thủy phân thu đƣợc.
Vì vậy, việc lựa chọn enzyme thích hợp cần nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình hoạt động của mỗi loại enzyme cũng nhƣ điều kiện tối thích của enzyme đó. Từ đó, chọn ra loại enzyme có khả năng thủy phân tốt tạo dịch thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao và có điều kiện hoạt động phù hợp nhất cho quá trình thủy phân thu dịch.
Trong đó chỉ tiêu để đánh giá hiệu quả hoạt động của enzyme đã chọn là hiệu suất thủy phân và khả năng chống oxy hóa của dịch thông qua đánh giá khả năng khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử của dịch thu đƣợc.
Trong đó, khả năng chống oxy hóa của dịch đƣợc tính nhƣ sau:
Khả năng chống oxy hóa = Khả năng chống oxy hóa của mẫu nghiên cứu – Khả năng chống oxy hóa của mẫu đối chứng
Trong đó, mẫu đối chứng là mẫu đƣợc thủy phân ở cùng điều kiện nhƣng không bổ sung enzyme.
Cách tiến hành:
Bố trí thí nghiệm thủy phân với bốn enzyme Alcalase, Protamex, Pepsin, Flavourzyme:
- Cùng nồng độ enzyme 5% so với hàm lƣợng protein ở nguyên liệu đầu tôm, thời gian 2 giờ.
- Tại nhiệt độ và pH thích hợp của từng lợi enzyme khác nhau. Bố trí mẫu dối chứng (không bổ sung enzyme) cùng nhiệt độ, pH với các mẫu thí nghiệm.
Sau khi thủy phân xong (trong 2 giờ) thu dịch rồi đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của từng dịch thu đƣợc của từng loại enzyme khác nhau đem so sánh đánh giá để lựa chọn enzyme phù hợp nhất.
Điều kiện tiến hành cụ thể theo bố trí thí nghiệm hình 2.2, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Dịch thịt
Đầu tôm tƣơi
Tách thịt đầu ra khỏi vỏ đầu
Vỏ đầu tôm Sử dụng để sản xuất chitin chitosan Mẫu 7: Không bổ sung enzyme, nhiệt độ: 55oC, pH = 7 Mẫu 4: Không bổ sung enzyme, nhiệt độ: 60oC, pH = 8 Mẫu 2: Enzyme pepsin, nhiệt độ: 40oC, pH = 2 Mẫu 3: Enzyme alcalase, nhiệt độ: 60oC, pH = 8 Mẫu 5: Enzyme protamex, nhiệt độ: 55oC, pH = 7 Mẫu 6: Enzyme flavourzyme, nhiệt độ: 55oC, pH = 7 Mẫu 1: Không bổ sung enzyme, nhiệt độ: 40oC, pH = 2
Thủy phân trong 2 giờ
Cô quay chân không
(Nhiệt độ 46oC, thời gian 18 phút, áp suất 48 bar) Ly tâm lạnh 5000 vòng/phút ở 4o
C trong 15 phút
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định mức độ ảnh hƣởng của enzyme đến thủy phân và khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein
2.3.2.3. Nghiên cứu tối ưu chế độ thủy phân để thu dịch có khả năng chống oxy hóa
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí chế độ thủy phân để thu dịch có khả năng chống oxy
hóa
Thịt đầu tôm
Thủy phân với enzyme đƣợc lựa chọn Thời gian 2 - 10 giờ pH thích hợp Nhiệt độ thích hợp Nồng độ enzyme 0,05 - 0,3%
Thu dịch thủy phân
Ly tâm lạnh
Xác định khả năng khử DPPH và tổng năng lực khử của dịch
Ở công đoạn trƣớc đã nghiên cứu ảnh hƣởng của các loại enzyme tới hoạt tính chống oxy hóa của dịch thu đƣợc, dựa vào kết quả đó chọn enzyme cho dịch có hoạt tính cao nhất và phù hợp nhất với điều kiện thí nghiệm.
Tiến hành bố trí thí nghiệm tối ƣu hóa quá trình thủy phân protein của thịt đầu tôm với các yếu tố nhiệt độ, pH tối thích nhƣ đã nghiên cứu ở mục 2.3.2.2 ảnh hƣởng của loại enzyme đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein (theo hình 2.2) và thời gian, nồng độ enzyme để chọn đƣợc chế độ phù hợp nhất đối với hoạt động của enzyme đó nhằm tối ƣu hóa quá trình thủy phân protein.
Tiến hành các nghiên cứu thăm dò và tham khảo các nguồn tài liệu xác định đƣợc miền giá trị của các thông số nhƣ sau:
- Nhiệt độ (oC): tối thích của enzyme đƣợc lựa chọn. - pH: tối thích của enzyme đƣợc lựa chọn.
- Thời gian (giờ): 2 - 10 giờ.
- Tỷ lệ enzyme bổ sung (%): từ 0,05 - 0,3% so với hàm lƣợng protein của