Nhóm enzyme protease xúc tác cho các quá trình thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid min.
Phân loại enzyme protease có thể căn cứ vào các tiêu chí sau [2]: - Cơ chế phản ứng của enzyme tham gia.
- pH tối thích cho hoạt động của enzyme nhƣ protease acid, protease kiềm, protease trung tính.
- Nguồn thu các enzyme protease. - Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme.
Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidease phân chia thành 2 loại:
+ Aminopeptidease: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
+ Carboxypeptidease: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidease đƣợc chia thành 4 nhóm [25]:
+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhómchymotrypsin bao gồm các enzyme động vật nhƣ chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm 2 loại enzyme vi khuẩn subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thƣờng hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tƣơng đối rộng.
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật nhƣ papain,
bromelin, một vài proteinase động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thƣờng hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa nhƣ : pepsin, chymosin, cathepsin, renin.
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng nhƣ các vi sinh vật cao hơn. Các metallo proteinase thƣờng hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dƣới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease đƣợc phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: + Protease acid: pH = 2 – 4.
+ Protease trung tính: pH = 7 – 8. + Protease kiềm: pH = 9 – 11.
1.2.1.2. Nguồn thu nhận enzyme protease
Nguồn thu nhận enyme protease chủ yếu từ 3 nguồn cơ bản sau: a. Nguồn động vật
Đây là nguồn enzyme đƣợc sử dụng từ rất lâu đời và có chứa nhiều enzyme nhất. Enzyme đuợc tách ra từ các mô nhƣ: tụy tạng, dạ dày, ruột và nội tạng của một số loài thủy sản (mực, cá…) thƣờng là trypsin, chymotrypsin, pepsin, cathepsin…
Ví dụ: trong dạ dày bê tồn tại enzyme thuộc nhóm protease tên là rennin thƣờng đƣợc sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat.
b. Nguồn thực vật
Có 3 loại protease thực vật nhƣ Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu đƣợc từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả,
chồi dứa, vỏ dứa. Các protease thực vật sử dụng trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hóa. Ficin thu đƣợc từ nhựa cây cọ (Ficus carica). Enzyme đƣợc sử dụng thủy phân protein tự nhiên.
c. Nguồn vi sinh vật
Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở qui mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn và một số loại nấm men.
+ Vi khuẩn:
Lƣợng protease sản xuất từ vi khuẩn ƣớc tính vào khoảng 500 tấn, chiếm khoảng 59% lƣợng enzyme đƣợc sử dụng. Protease sản xuất từ vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao, có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein. Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là
Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc
chi Clostridium. Trong đó, B.subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất
[2].
+ Nấm:
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lƣợng lớn protease đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
terricola, A.fumigatus, A.saitoi, Penicillium chysogenum… Một số nấm mốc
khác nhƣ: A.candidatus, P.cameberti, P.roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng sản xuất phomat.
+ Xạ khuẩn
Về phƣơng diện tổng hợp protease, xạ khuẩn đƣợc nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, ngƣời ta cũng đã tìm đƣợc một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao nhƣ: Streptomyces grieus, S. fradiae, S.rerimosus...
1.2.2. Các yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng hoạt động của enzyme protease
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, xúc tác cho các phản ứng bên trong và ngoài cơ thể. Hoạt động của enzyme phụ thuộc chặt chẽ vào nhiều yếu tố khác nhau nhƣ: nhiệt độ, pH môi trƣờng, nồng độ enzyme và cơ chất, chất ức chế, chất hoạt hóa… Tất cả các yếu tố trên nếu thích hợp thì vận tốc phản ứng do enzyme sẽ là tối đa.
a. Ảnh hƣởng của nhiệt độ:
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hƣởng đến tính chất của enzyme. Nhiệt độ cao làm biến tính không thuận nghịch enzyme. Bản chất của enzyme là protein nên khi tăng hay giảm nhiệt độ thƣờng ảnh hƣởng tới hoạt tính của enzyme và enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ nhất định. Nhiệt độ thấp làm biến tính thuận nghịch enzyme, tức là khi đƣa enzyme từ nhiệt độ thấp lên nhiệt độ bình thƣờng, thì enzyme sẽ phục hồi khả năng xúc tác của mình nên ngƣời ta thƣờng bảo quản enzyme ở nhiệt độ thấp. Giá trị nhiệt độ mà enzyme bắt đầu mất hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn. Giá trị nhiệt độ mà enzyme thể hiện cao nhất khả năng xúc tác gọi là nhiệt độ tối thích. Cùng một enzyme nhƣng lấy từ các nguồn khác nhau thì vùng nhiệt độ tối thích cũng khác nhau.
Thông thƣờng đối với đa số enzyme thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40 - 500
Cvà nhiệt độ lớn hơn 700C đa số enzyme bị mất hoạt tính. Do vậy nhiệt độ 700C gọi là nhiệt độ tới hạn của enzyme.
Trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của enzyme, nếu nhiệt độ tăng 100C thì tốc độ thủy phân của enzyme tăng từ 1,5 - 2 lần. Nhiệt độ thích hợp đối với một enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH và cơ chất.
Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH bởi vì pH của môi trƣờng ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hƣởng đến độ bền của enzyme. Mỗi enzyme chỉ hoạt động ở một vùng pH nhất định gọi là pH tối thích, pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng trung tính, acid yếu hoặc kiềm yếu, chỉ rất ít enzyme hoạt động mạnh trong vùng acid hay kiềm.
Nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm có thể bị thủy phân bởi enzyme protease có sẵn trong đầu tôm vì thế chúng ta phải chọn enzyme nào đóng vai trò là enzyme chính xúc tác cho quá trình thủy phân để tạo môi trƣờng có pH thích hợp cho nó hoạt động và hạn chế ảnh hƣởng của các enzyme khác. Tại pH tối thích thì enzyme lẫn cơ chất đạt đến trạng thái ion hóa thích hợp nhất khiến cho chúng dễ dàng kết hợp với nhau nên vận tốc phản ứng tăng lên.
c. Ảnh hƣởng của thời gian:
Thời gian thủy phân kéo dài hay rút ngắn đều ảnh hƣởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân và chất lƣợng của sản phẩm. Thời gian tác dụng kéo dài, enzyme có điều kiện để cắt mạch triệt để dẫn đến sự biến đổi sâu sắc của cơ chất. Nhƣng nếu kéo dài thời gian thủy phân quá mức sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật hoạt động làm sản sinh ra nhiều sản phẩm cấp thấp nhƣ: NH3, H2S, indol, scaptol… đồng thời khi kéo dài hiệu quả kinh tế kém. Khi rút ngắn thời gian thủy phân, sự thủy phân protein chƣa triệt để dẫn tới hiệu suất thủy phân thấp, gây lãng phí nguyên liệu và gây khó khăn cho khâu lọc rửa để thu dịch protein. d. Ảnh hƣởng của diện tích tiếp xúc:
Khi thủy phân diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease và nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm cũng ảnh hƣởng rất lớn đến tốc độ thủy phân. Để tạo điều kiện cho enzyme protease hoạt động tốt ngƣời ta thƣờng xay nhỏ nguyên liệu,
khi diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease với protein càng lớn thì quá trình thủy phân càng dễ dàng và ngƣợc lại.
e. Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme:
Trong điều kiện thừa cơ chất, nếu càng tăng nồng độ enzyme protease thì quá trình thủy phân xảy ra càng mãnh liệt. Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất, dù tăng nồng độ enzyme bao nhiêu đi nữa vận tốc của quá trình thủy phân rất ít thay đổi.
f. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất:
Khi enzyme protease kết hợp với cơ chất là nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm sẽ tạo thành phức trung gian enzyme và cơ chất. Phức chất này sẽ kéo căng liên kết peptide, chuyển hóa thành sản phẩm dịch đạm và giải phóng enzyme.
Quá trình này cứ tiếp tục xảy ra đến khi cơ chất hết, nếu nồng độ cơ chất thích hợp với lƣợng enzyme sẽ làm cho quá trình thủy phân diễn ra đều đặn, nhanh chóng.
g. Ảnh hƣởng độ tƣơi của nguyên liệu:
Thành phần hóa học của đầu tôm ngoài chitin, protein, astaxanthin, còn có một lƣợng lớn enzyme nội tạng tại thuộc họ protease. Theo các nghiên cứu của các nhà khoa học trƣờng Đại học Nha Trang đã chứng minh rằng hoạt độ enzyme protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g.
Các enzyme này chủ yếu tồn tại trong nội tạng của đầu tôm nguyên liệu tƣơi. Chính vì vậy mà độ tƣơi nguyên liệu có ảnh hƣởng lớn tới hoạt động của protease nguyên liệu càng tƣơi thì lƣợng enzyme càng nhiều hoạt động càng mạnh và ngƣợc lại.
Do vậy chất lƣợng của nguyên liệu là mối quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu về thủy phân protein để đảm bảo chất lƣợng sản phẩm mà còn ảnh hƣởng nhiều tới hiệu quả thủy phân của protease [14].
h. Ảnh hƣởng của tỷ lệ nƣớc bổ sung vào hỗn hợp thủy phân:
Nƣớc là yếu tố ảnh hƣởng quan trọng đến phản ứng thủy phân. Nó có khả năng điều chỉnh phản ứng thủy phân, bởi lẽ nƣớc là môi trƣờng tăng cƣờng quá trình phân cắt các liên kết nhị dƣơng, là môi trƣờng khuyếch tán enzyme và cơ chất tạo điều kiện cho tốc độ phản ứng xảy ra. Do vậy quá trình thủy phân nguyên liệu đầu tôm nếu ta bổ sung nƣớc với tỷ lệ thấp sẽ hạn chế đƣợc hoạt động của vi sinh vật nhƣng đồng thời ức chế hoạt động của enzyme làm giảm hiệu suất thủy phân. Nhƣng nếu bổ sung nƣớc với tỷ lệ quá cao, vi sinh vật hoạt động và phát triển phân hủy sản phẩm thành các sản phẩm thứ cấp. Vì vậy, ta phải xác định tỷ lệ nƣớc bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân.
i. Ảnh hƣởng của chất kìm hãm:
Là chất làm giảm khả năng xúc tác hoặc vô hoạt enzyme, chất kìm hãm kết hợp thuận nghịch với enzyme. Những chất kìm hãm thƣờng là những chất hữu cơ phân tử nhỏ, các ion lạ, đặc biệt là các ion kim loại nặng rất độc với enzyme (Cu2+ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
, Hg2+, Cd2+…). Nó có thể là chất kìm hãm thuận nghịch hay bất thuận nghịch. Kìm hãm thuận nghịch có thể là cạnh tranh, không cạnh tranh hay hỗn tạp.
j. Ảnh hƣởng của chất hoạt hóa:
Chất kích hoạt là những chất có khả năng làm tăng hiệu lực xúc tác của enzyme hoặc chuyển enzyme từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động. Mỗi enzyme đòi hỏi cho mình chất hoạt hóa riêng.
Vai trò của chất hoạt hóa: Phục hồi một số nhóm chức hoạt động yếu hoặc không hoạt động thành hoạt động. Chất hoạt hóa có tác dụng cắt một số đoạn
peptide đang ức chế hoạt động của enzyme để hình thành lại trung tâm hoạt động của enzyme và enzyme trở nên hoạt động. Chất hoạt hóa có thể làm cho các ion kim loại, phi kim làm cầu nối giữa enzyme và cơ chất hoặc làm tăng diện tích tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất.
Các chất hoạt hóa có khả năng cắt đứt một vài đoạn peptide đang kìm hãm sự hình thành trung tâm hoạt động của enzyme. Chất hoạt hóa có thể kết hợp vào các điểm dị không gian giúp trung tâm hoạt động biến đổi theo hƣớng có lợi và chất xúc tác. Chất kích hoạt có thể là ion kim loại kiềm: Ba2+, Ca2+, Cl-, Br-, I-… những ion này có vai trò làm cầu nối giữa enzyme với cơ chất, tăng diện tích tiếp xúc giữ enzyme với cơ chất, ổn định cấu trúc không gian cần cho sự xúc tác. Ngoài ra, chất hoạt hóa còn có vai trò phục hồi nhóm chức chƣa hoạt động hoặc hoạt động ít trở nên hoạt động mạnh mẽ hơn.
1.2.3. Hệ enzyme protease của tôm
Sự tiêu hóa và trao đổi chất protein, các hợp chất nitơ khác giữa các loài giáp xác khác nhau rất nhiều. Các enzyme tiêu hóa đặc biệt là enzyme tiêu hóa protein ở giáp xác nói chung và của tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của cá. Protease ở tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsin và có khả năng hoạt động rất cao. Ngoài ra, còn có enzyme chymotrypsin, actacine. Qua một số nghiên cứu cho thấy enzyme ở tôm nói chung là các protein kiềm tính. Các enzyme này có tính chất chung của enzyme:
- Hòa tan trong nƣớc, dung dịch nƣớc muối và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào tính chất này để tách chiết chúng.
- Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa, ethanol, aceton để thu chế phẩm enzyme.
- Hoạt tính của enzyme có thể tăng hay giảm dƣới tác dụng của các chất hoạt hóa hoặc chất ức chế.
- Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hƣởng lớn bởi các yếu tố: nhiệt độ, pH môi trƣờng.
Protease của tôm cũng nhƣ các loài động vật thủy sản khác là các enzyme nội bào, tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hóa đến nội tạng và cơ thịt. Do đặc điểm hệ tiêu hóa nội tạng của tôm nằm ở phần đầu nên hệ enzyme tập trung nhiều nhất ở phần đầu.
- Trypsin: Có trong dịch vị tụy tạng, khả năng tác dụng của trypsin khá mạnh với các loại protein có phân tử lƣợng thấp ở các liên kết peptide. Trypsin từ ruột tôm có pH thích hợp là 7,8 ở 38o
C.
- Peptidease, ereptase và các loại khác: Tham gia thủy phân liên kết peptide và các polypeptide. Khả năng tác dụng cũng nhƣ tính đặc hiệu của enzyme này phụ thuộc vào bản chất của các nhóm nằm liền kề bên mối liên kết peptide.
- Cacbonhydrase: Enzyme này xúc tác thủy phân các glucid và glucozit. Ngoài ra, trong đầu tôm có chứa enzyme tiêu hóa chymotrypsin [14] đƣợc sử dụng trong điều trị ung thƣ, ngoài ra trong vỏ tôm còn có một số enzyme khác nhƣ alkaline photphatase, β-N-acetylglucosamidase, deacetylase, chitinase [1] cũng đƣợc ứng dụng nhiều trong thực tế. Đa số các enzyme nội tại trong phế liệu tôm là các enzyme có khả năng xúc tác cho các phản ứng thủy phân cắt mạch protein, cho nên khi tiến hành quá trình thủy phân protein trên đầu tôm cũng cần quan tâm đến enzyme nội tại này.
Qua các nghiên cứu cho thấy từ đầu tôm có thể sản xuất ra nhiều loại sản phẩm hữu ích khác nhƣ chitin - chitosan, chiết các hợp chất mang màu, thu nhận enzyme và trong đầu tôm còn chứa một lƣợng thịt có thể tận dụng để thu hồi protein từ đầu tôm có chứa các hợp chất sinh học. Vì vậy, đã có nhiều nghiên cứu tập trung các hƣớng này để thu hồi protein từ đầu tôm và ứng dụng trong một số lĩnh vực nhƣ thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và phân bón...
Hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein đã đƣợc nhiều nhà nghiên