- Tắnh mẫn cảm với kháng sinh của các chủng Ẹcoli phân lập
3.3.3.Phương pháp xác ựịnh cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Ẹcoli và Salmonella phân lập ựược
3 Proteus Mọc lan tràn Trắng 4 Enterobacter
3.3.3.Phương pháp xác ựịnh cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Ẹcoli và Salmonella phân lập ựược
và Salmonella phân lập ựược
3.3.3.1. Xác ựịnh cấu trúc kháng nguyên của các chủng Ẹcoli
được thực hiện theo phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kắnh; các chủng vi khuẩn ựược tiến hành xác ựịnh nhóm với các huyết thanh ựa giá trước, sau ựó ựến các huyết thanh ựơn giá trong nhóm.
- Chuẩn bị:
+ Chủng vi khuẩn Ẹcoli cần xác ựịnh serotype ựược cấy trên thạch máu cừu, ủ ở tủ ấm 370C trong 18 - 24 giờ.
+ Các kháng huyết thanh O chuẩn (ựa giá và ựơn giá) do hãng Denka, Seiken Cọ, Ltd, Niigata (Nhật) cung cấp.
+ Nước muối sinh lý 0,85%, phiến kắnh sạch, que cấy nhựạ
- Phương pháp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh như sau:
Nhỏ lên phiến kắnh sạch, mỗi ựầu một giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng, lấy khuẩn lạc Ẹcoli cần xác ựịnh ựã ựược nuôi trên môi trường thạch máu, trộn ựều với 2 giọt nước muối sinh lý ựể tạo thành huyễn dịch vi khuẩn. Nhỏ một giọt kháng huyết thanh chuẩn vào một bên huyễn dịch và
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
một giọt nước sinh lý vào bên huyễn dịch còn lại (ựối chứng). Nếu có phản ứng ngưng kết, sẽ xuất hiện trong vòng 30 giâỵ Phản ứng dương tắnh khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là vi khuẩn với kháng huyết thanh, tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tách ra làm 2 phần là các hạt ngưng kết và phần nước trong. Với phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, rõ rệt thì ựược ựánh giá mức ++++. Tùy theo khả năng ngưng kết ựể có thể ựánh giá mức ngưng kết ở các mức ựộ khác nhau +, ++, +++. Phản ứng là âm tắnh khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh ựục ựều như bên ựối chứng.
Với những chủng có ngưng kết với kháng huyết thanh ựa giá, tiếp tục thực hiện như vậy với các kháng huyết thanh ựơn giá thuộc nhóm ựể xác ựịnh rõ từng serotypẹ Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hoặc ngưng kết với nhiều ựơn giá khác nhau, thì phải pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số 2, kết quả sẽ lấy ngưng kết ở cấp số pha loãng cao nhất.
3.3.3.2. Xác ựịnh cấu trúc kháng nguyên của các chủng Salmonella spp. được tiến hành ựịnh type theo phương pháp Kauffmann
* Xác ựịnh nhóm kháng nguyên O bằng huyết thanh ựa giá
Sử dụng phản ứng ngưng kết nhanh với kháng nguyên O của vi khuẩn
Salmonella. Phương pháp tiến hành như sau:
Phiến kắnh sạch ựược chia làm hai phần. Dùng ống hút paster hoặc que cấy vô trùng, nhỏ mỗi bên phiến kắnh một giọt nước sinh lý. Dùng que cấy vô trùng, lấy một ắt khuẩn lạc ựiển hình của chủng vi khuẩn Salmonella cần ựịnh typ ựã mọc trên môi trường thạch máu, trộn ựều với nước sinh lý ựã nhỏ sẵn ở bên phiến kắnh thành huyễn dịch kháng nguyên. Sau ựó tiến hành nhỏ một giọt huyết thanh ựa giá nhóm O vào huyễn dịch kháng nguyên ựã chuẩn bị ở hai bên thắ nghiệm, còn bên ựối chứng thì nhỏ 1 giọt nước sinh lý (ựối chứng âm) và trộn ựềụ Sau 1-2 Phút ựọc kết quả.
Phản ứng dương tắnh khi có cụm ngưng kết xuất hiện, nước xung quanh trong
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
đối chứng âm: Hai bên hỗn dịch vẫn ựục ựều
Nếu cả hai bên xuất hiện ngưng kết, thắ ựó là ngưng kết giả, phải làm lại thắ nghiệm
* Xác ựịnh kháng nguyên O bằng huyết thanh ựơn giá
Chọn những chủng Salmonella ựã ngưng kết với huyết thanh ựa giá nhóm O, tiến hành làm ngưng kết như trên với tất cả huyết thanh nhóm O ựơn giá thuộc nhóm ựã ngưng kết. Nếu chủng vi khuẩn ngưng kết với huyết thanh O ựơn giá nào thì thuộc serotype O ựó.
* Xác ựịnh kháng huyết thanh H với kháng huyết thanh H ựa giá ựối với vi khuẩn Salmonella:
Cho vào ống nghiệm 2,5ml canh trùng một lượng tương ựương dung dịch Salin và formon, sau khi ựể 3 giờ ở nhiệt ựộ phòng, lấy một ống vô trùng mới, cho vào ựó 0,25 ml hỗn dịch nói trên, cho thêm vào ựó 0,25 ml kháng huyết thanh ựã pha sẵn hoặc 1 giọt kháng huyết thanh H ựa giá, ựun cách thủy 500C trong 1 giờ.
* đọc kết quả
+ Phản ứng dương tắnh khi kháng nguyên và kháng huyết thanh kết hợp với nhau, tạo nên kết tủa bông ở ựáy ống nghiệm
+ Phản ứng âm tắnh khi không có kết tủa ở ựáy ống nghiệm.
* Xác ựịnh kháng nguyên H với kháng huyết thanh ựơn giá của vi khuẩn Salmonella
Tương tự như xác ựịnh kháng nguyên O ựơn giá nhưng phải tiến hành làm 2 phản ứng với 2 pha: Pha 1 (ựặc hiệu) và pha 2 (không ựặc hiệu)
Sau ựây là cấu chúc kháng nguyên của 3 chủng Salmonella thường gặp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
S.typhimurium O1,4[4],12 Hi: 1,2
S.enteritidis O1, 9, 12 H [f], g, m, [p]: [1,7]
S. choleraesuis O 6, 7 Hc 1,5