CAPD-R 5Ỗ-CAT CTA CCC ACT CAA CCA TAT CAG-3Ỗ

- Phòng bệnh:

3. đỐI TƯỢNG Ờ NỘI DUN G NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CAPD-R 5Ỗ-CAT CTA CCC ACT CAA CCA TAT CAG-3Ỗ

657

Quy trình thực hiện phản ứng PCR như sau:

- ADN mẫu của chủng vi khuẩn cần xác ựịnh ựược lấy trực tiếp từ khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn ựã ựược nuôi cấy 370C/24h trên môi trường thạch máụ

- Phản ứng PCR ựược thực hiện với tổng thể tắch là 25 ộl, bao gồm các thành phần: 1 ộl của mỗi loại mồi (3,2 ộM/ ộl), 5 ộl PCR buffer 5x [(750 mM Tris-HCl (pH 8,8), 200 mM (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) Tween 20) (ABgene), 2 mM

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39 MgCl2, 200 ộM của mỗi loại dNTP], 0,05 ộl Taq DNA Polymerase (5 units/ ộl) (ABgene), nước cất vừa ựủ 25 ộl.

- Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR gồm các giai ựoạn: tiền biến tắnh ở 940C/3 phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tắnh ở 940C/1 phút, ủ bắt cặp mồi ở 550C/1 phút, tổng hợp ở 720C/1 phút), và kéo dài cuối cùng ở 720C/7 phút.

- Sản phẩm của phản ứng PCR ựược ựiện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch 1xTAE với hiệu ựiện thế 100V/30 phút, sau ựó nhuộm với Ethidium bromide trong 15-20 phút. đọc kết quả bằng hệ thống Gel Doc 2000. Các vạch ADN ựược ựánh giá bằng cách so sánh với ADN lađer chuẩn và mẫu ựối chứng dương.

3.4.4.3. Phương pháp xác ựịnh serotype của vi khuẩn S. suis bằng phản ứng PCR.

Các serotype 1, 2, 7 và 9 của vi khuẩn Streptococcus suis thường gặp gây bệnh nhất ở lợn ựược xác ựịnh bằng phản ứng Multiplex PCR. Các cặp mồi dùng ựể xác ựịnh các serotype 1, 2, 7 và 9 của Streptococcus suis ựược lựa chọn dựa vào chuỗi gen mã hoá quá trình sinh tổng hợp thành phần polysaccharide của giáp mô (cps), gồm 4 cặp mồi: cps 1J-F và cps 1J-R ựể xác ựịnh serotype 1, cps 2J-F và cps 2J-R ựể xác ựịnh serotype 2, cps 7H-F và cps 7H-R ựể xác ựịnh serotype 7, cps 9H-F và cps 9H-R ựể xác ựịnh serotype 9. Trình tự các cặp mồi và các sản phẩm tương ứng của chúng ựược trình bày ở bảng 3.2.

Thành phần của phản ứng Multiplex PCR dùng ựể xác ựịnh serotype của vi khuẩn Streptococcus suis tương tự như trong phản ứng dùng ựể xác ựịnh serotype của vi khuẩn P. multocida. Chu kỳ nhiệt của phản ứng gồm: tiền biến tắnh ở 940C/5 phút và 35 chu kỳ nhiệt (biến tắnh ở 940C/1 phút, ủ bắt cặp mồi ở 530C/1 phút, tổng hợp ở 720C/90 giây) và kéo dài cuối cùng ở 720C/7 phút.

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40

Bảng 3.2. Trình tự các cặp mồi dùng ựể xác ựịnh các serotype 1, 2, 7 và 9 của vi khuẩn Streptococcus suis

Serotype Ký hiệu mồi Trình tự mồi Sản phẩm (bp) 1 cps1J-F cps1J-R 5'-TGG CTC TGT AGA TGA TTC TGC T -3'

5'-TGA TAC GTC AAA ATC CTC ACC A-3' 637

2 cps2J-F

cps2J-R

5'-TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG-3'

5'-TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC -3' 498

7 cps7H-F

cps7H-R

5'-AAT GCC CTC GTG GAA TAC AG-3'

5'-TCC TGA CAC CAG GAC ACG TA-3' 379

9 cps9H-F

cps9H-R

5'-GGG ATG ATT GCT CGA CAG AT-3'

5'-CCG AAG TAT CTG GGC TAC TGA-3' 303