Pha loãng tinh trùng là yếu tố kích hoạt tinh trùng hoạt lực và duy trì khả năng thụ tinh của tinh trùng trong môi trường thụ tinh. Pha loãng tinh trùng ở một tỉ lệ thích hợp thì kích hoạt tất cả các tinh trùng cùng một lúc và tránh sai sót trong trường hợp quan sát tinh trùng ở mật độ cao [38]. Ở một số loài cá, mật độ tinh trùng quá dày nên tinh trùng phải cạnh tranh nhau trong một không gian hẹp trong quá trình bơi đến trứng để tiến hành thụ tinh. Vì vậy, tinh trùng bị tiêu hao nhiều năng lượng nên chết nhanh hơn [121, 128]. Tuy nhiên, mật độ tinh trùng quá thưa cũng làm giảm khả năng thụ tinh của tinh trùng do quãng đường chúng bơi đến trứng xa hơn. Do đó, tỉ lệ pha loãng tối ưu là một yếu tố quan trọng để tất cả tinh trùng hoạt lực tốt đạt kết quả thụ tinh cao [33, 51].
Tỉ lệ pha loãng ở các loài khác nhau thì khác nhau, nó phụ thuộc vào mật độ tinh trùng của loài [97]. Nhận định chung của nhiều nghiên cứu trên các loài cá khác nhau thì những loài có mật độ tinh trùng tương đối cao tỉ lệ pha loãng thường là 1:100 (1ml tinh trùng: 99 ml dung dịch), còn những loài có mật độ tinh trùng thấp tỉ lệ pha loãng là 1:50 [64, 89]. Tỉ lệ pha loãng tốt nhất ở cá Tầm (Acipenser persicus) là 1:50 [64], cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus) là 1:100 [5]. Tỉ lệ pha loãng còn ảnh hưởng đến hoạt lực của tinh trùng cá [78, 128]. Tinh trùng cá chép hoạt lực lâu nhất đạt 6 phút ở tỉ lệ pha loãng 1:100, tỉ lệ pha loãng 1:50 thì thời gian tinh trùng hoạt lực ngắn hơn ở tỷ lệ 1:100 [105].
pH ngoại bào, pH nội bào và thành phần ion của dung dịch kích hoạt có ảnh hưởng đến sự khởi đầu và thời gian hoạt lực của tinh trùng [15]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự ảnh hưởng của pH môi trường với hoạt lực của tinh trùng. Ở cá tầm (Acipenser transmontanus)các giá trị pH < 7,5 bắt đầu ức chế tinh trùng hoạt lực, nếu duy trì ở giá trị pH > 8,2 tinh trùng hoạt lực tốt nhất [71]. Trong một nghiên cứu thực hiện trên cá vền biển (Sparus aurata), việc sử dụng nước biển nhân tạo với pH=9,3 cho thấy tinh trùng hoạt lực nhanh nhất và tỉ lệ phần trăm hoạt lực cao nhất [32]. Thực tế này cũng được quan sát ở cá bơn (Psettodes erumei), khả năng vận động có thể được bắt đầu trong điều kiện đẳng trương nếu pH trong tế bào tăng. Hầu như ở tất cả các loài, phạm vi pH để kích hoạt khả năng vận động của tinh trùng là khá lớn, từ acid (pH = 5) đến kiềm (pH =10) (cá chẽm, cá chép, cá đối) [34].
1.3.2.3. Nồng độ thẩm thấu
Ở hầu hết các loài cá, yếu tố khởi đầu kích hoạt hoạt lực tinh trùng là sự thay đổi nồng độ thẩm thấu: gia tăng nồng độ thẩm thấu đối với các loài cá biển và giảm nồng độ thẩm thấu đối với cá nước ngọt bằng cách thay đổi nồng độ ion [59, 93]. Khi tinh trùng vào môi trường có nồng độ thẩm thấu cao hơn nồng độ thẩm thấu ở tế bào chất của tinh trùng thì nước từ trong tế bào chất đi ra ngoài, tinh trùng bị mất nước, teo lại, đuôi không linh hoạt, dần dần tinh trùng ngừng hoạt lực và mất khả năng thụ tinh. Ngược lại, nếu tinh trùng vào môi trường có nồng độ thẩm thấu thấp hơn nồng độ thẩm thấu ở tế bào chất của tinh trùng thì nước môi trường ngoài có xu hướng thấm vào tinh trùng làm cho tinh trùng bị trương phồng lên dẫn tới vỡ tế bào. Trong môi trường đẳng trương, nồng độ thẩm thấu của môi trường ngoài bằng nồng độ thẩm thấu trong tinh dịch thì tinh trùng không phải tiêu hao năng lượng cho việc điều chỉnh nồng độ thẩm thấu. Vì vậy, tuổi thọ của tinh trùng được kéo dài.
Các loài cá nước ngọt tinh trùng được kích hoạt khi tiếp xúc với môi trường nhược trương còn ở các loài cá biển là môi trường ưu trương [94]. Có một số loài cá, kích hoạt tinh trùng hoạt lực bằng cách sử dụng môi trường từ các loại đường hoặc các hợp chất khác không chứa ion, chẳng hạn như cá tráp (Sparus aurata), cá
nóc (Takifugu niphobles), cá vền biển (Sparus aurata). Điều này chứng minh rằng nhân tố làm tinh trùng hoạt lực là nồng độ thẩm thấu. Trong hầu hết các loài cá, thay đổi nồng độ thẩm thấu (0 – 300 mOsm/kg) tinh trùng bắt đầu di động [34]. Đặc biệt đối với các loài cá có khả năng chịu được độ mặn cao, tinh trùng hoạt lực phụ thuộc vào thời gian thích ứng với môi trường nước, cá thích nghi với nước biển độ mặn cao thì tinh trùng sẽ được kích hoạt trong nồng độ thẩm thấu lên tới gần 1000 mOsm/kg (tương tự như NDTT của nước biển) [88]. Tóm lại, nồng độ thẩm thấu của môi trường bằng nồng độ thẩm thấu trong tinh dịch là tốt nhất cho tinh trùng hoạt lực.
Khoảng nồng độ thẩm thấu cho tinh trùng hoạt lực phụ thuộc vào loài. Ở đa số cá nước ngọt cho thấy tinh trùng hoạt lực trong môi trường có nồng độ thẩm thấu thấp như ở cá vàng (Carassius auratus) và cá chép (Cyprinus carpio) thời gian tinh trùng hoạt lực dài trong môi trường có nồng độ thẩm thấu 100 – 200 mOsm/kg [94, 109]. Trong khi đó, ở các loài cá biển tinh trùng hoạt lực trong các dung dịch có nồng độ thẩm thấu cao hơn 300 – 400 mOsm/kg như tinh trùng cá bơn (Hippoglossus sp) bắt đầu hoạt lực ở nồng độ thẩm thấu trên 300 mOsm/kg [123], ở cá chẽm châu Âu (Dicentrarchus labrax) là 400 – 1100 mOsm/kg [13], cá rô phi đen (Sarathoredon melanotheron) từ 333 – 645 mOsm/kg [96], cá bơn (Scophthalmus maximus) 350 – 1200 mOsm/kg [115] và cá nóc biển (Takifugu niphobles) 400 mOsm/kg [15].
1.3.2.4. Nhiệt độ
Nhiệt độ môi trường bên ngoài có thể làm thay đổi thời gian hoạt lực của tinh trùng ở một số loài cá [36]. Trong phạm vi nhiệt độ thích hợp, tốc độ hoạt lực của tinh trùng tăng khi nhiệt độ tăng nhưng thời gian sống của tinh trùng ngắn lại, do nhiệt độ tăng làm quá trình oxy hóa vật chất trong tinh trùng diễn ra nhanh nên sự tiêu hao năng lượng lớn. Nếu nhiệt độ vượt quá giới hạn cho phép thì tinh trùng nhanh chóng mất khả năng hoạt lực và chết. Tinh trùng có thể duy trì khả năng thụ tinh của chúng khá lâu nếu được giữ ở nhiệt độ thấp 0 – 4oC. Dựa vào những đặc điểm này người ta đã tiến hành phương pháp bảo quản tinh trùng ở nhiệt độ thấp để kéo dài tuổi thọ của tinh trùng. Tinh trùng cá chép bảo quản ở nhiệt độ 0 – 2ºC thì sống được 8 ngày, tinh trùng cá tầm ở 0 – 4ºC nếu bảo
quản tốt có thể sống được 19 ngày [17]. Ở cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss), thời gian tinh trùng hoạt lực là khoảng 140s ở 5ºC và giảm xuống còn 70s ở 10ºC. Cá tầm (Acipenserbaeri) tinh trùng hoạt lực cao nhất ở mức 10ºC và thấp nhất là 17,5ºC [53]. Như vậy, với những loài cá sống trong môi trường nhiệt độ khác nhau thì tinh trùng cũng thích nghi với khoảng nhiệt độ của môi trường mà cá đang sống [52]. Hay nhiệt độ cho tinh trùng hoạt lực tốt nhất tương đương với phạm vi nhiệt độ nước nơi sinh sản của loài cá đó trong tự nhiên [59].
1.3.2.5. Ảnh hưởng các ion
Trong các nghiên cứu về tinh dịch cá, các ion có vai trò quan trọng kích hoạt tinh trùng hoạt lực là K+, Ca2+, Na+, Mg2+. Hàm lượng các ion này được tìm thấy trong môi trường thụ tinh gần như tương ứng với hàm lượng ion có trong dịch tương của cá. Tuy nhiên, so với môi trường nội bào, môi trường bên ngoài còn chứa nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực tinh trùng [67]. Khi tinh trùng được phóng thích ra môi trường bên ngoài, làm thế nào để tinh trùng hoạt lực nhanh nhất, thời gian lâu nhất và khả năng tiếp cận trứng tốt nhất để thụ tinh là chìa khóa thành công trong sản xuất giống nhân tạo. Để làm được điều này thì chúng ta phải tạo ra môi trường tốt nhất cho tinh trùng hoạt lực [25].
Natri: Na+ được biết là có vai trò thứ yếu trong việc kích hoạt và duy trì hoạt lực
của tinh trùng cá. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của Na+ lên tinh trùng cá còn rất hạn chế, gần đây vai trò của Na+ được biết đến qua một nghiên cứu trên tinh trùng cá trích (Sardinella aurit). Vines và ctv đã phát hiện sự trao đổi hàm lượng Na+/Ca2+ trong tinh trùng của cá trích, tinh trùng bắt đầu hoạt lực khi đảo ngược sự trao đổi Na+/Ca2+ [23]. Thời gian tinh trùng loài cá này hoạt lực có thể dài hơn 60 phút, các tế bào có thể điều chỉnh tăng Ca2+ bên trong bằng cách hoạt động trong một chế độ đảo ngược [124].
Kali: ảnh hưởng của Ca2+ và K+, 2 ion lớn hiện diện trong dịch tương của cá đã
được nghiên cứu [103]. Hai ion này được xem là chìa khóa để kích hoạt tinh trùng hoạt lực ở các loài cá biển, đặc biệt là nhóm cá hồi Salmonids và cá tầm Acipenseridae. Trong nhóm cá hồi Salmonids, dịch tương có chứa nồng độ cao K+ (từ 20 đến 60 mM) có thể liên quan đến sự bất hoạt của tinh trùng trong tinh dịch [55, 93, 94]. Tinh trùng được kích
hoạt bởi nồng độ K+ môi trường bên ngoài giảm thông qua màng tế bào. Ngoài K+ liên quan đến sự kích hoạt tinh trùng hoạt lực thì các ion khác cũng góp phần đáng kể trong chức năng này [94]. Một số nghiên cứu xác nhận các ion hoá trị hai như Ca2+ và Mg2+
trong môi trường thụ tinh thường đối kháng hay ức chế ion K+ [18]. Alavi và Cosson đã đưa ra giả thuyết rằng các yếu tố ức chế nồng độ K+ phụ thuộc vào sự nhạy cảm của tinh trùng với ion này có sự thay đổi giữa con đực và mùa sinh sản. Có thể do những thay đổi theo mùa làm thay đổi nồng độ K+ và Ca2+ trong dịch tương của cá [120].
K+ là một chất ức chế chủ yếu tinh trùng cá tầm (Acipenser persicus) hoạt lực. Nồng độ K+ trong dịch tương cá tầm (Acipenser persicus) là 6,92±0,88 mM. Còn ở cá
Macrozoarces americanus, nồng độ K+ từ 10 – 20 mM, giá trị này tương ứng với nồng độ trong dịch tương. Tinh trùng của họ cá chép Cyprinidae và cá hồi Salmonids ít nhạy cảm với K+, nhưng hoạt lực của tinh trùng cá chép vẫn bị suy giảm trong môi trường nồng độ cao K+, trong môi trường đó các tế bào ở trạng thái bất động. Như vậy K+ là một ion quan trọng kiểm soát sự hoạt lực của tinh trùng cá [20, 95, 124].
Canxi: Ca2+ ngoại bào là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự khởi đầu hoạt lực của
tinh trùng ở một số loài cá [86, 131]. Ca2+ từ bên ngoài vào tế bào chất của tinh trùng, kích hoạt một số enzym hoặc các protein kích thích tinh trùng hoạt lực [124]. Trong tinh trùng cá chép, các dòng Ca2+ ngoại bào từ ngoài vào đã làm giảm Ca2+ trong nội bộ tế bào, nhưng khi không có Ca2+ từ bên ngoài vào thì việc giải phóng Ca2+ từ bên trong tế bào do các cơ chế khác sẽ không kích hoạt tinh trùng hoạt lực. Do đó, sự xâm nhập của Ca2+ từ bên ngoài là quan trọng. Nghiên cứu ở cá nóc (Takifugu niphobles), cá rô phi (Oreochromis mossambicus) cho thấy nếu không có Ca2+ ngoại bào thì Ca2+ nội bào tăng lên trong suốt quá trình kích hoạt tinh trùng hoạt lực [69]. Gần đây có một số nghiên cứu cho thấy sự đóng góp của Ca2+ nội bào trong ti thể hoặc từ màng nội chất cũng làm tăng nồng độ Ca2+ trong tế bào kích thích tinh trùng hoạt lực [15, 16, 66, 67].
Magie: Mg2+ là một ion thứ yếu trong dịch tương cá liên quan đến kích hoạt tinh
trùng hoạt lực. Theo một số nghiên cứu trên cá nước ngọt, ion Mg2+ ức chế sự hoạt động của ion K+ [34].
1.3.2.6. Ánh sáng
Khi ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp lên tinh trùng, tuổi thọ của tinh trùng sẽ bị suy giảm vì hiệu ứng quang hợp của tia tử ngoại và hiệu ứng nhiệt quang của tia hồng ngoại làm tăng hoạt lực của tinh trùng nên chúng chết rất nhanh do mất năng lượng [12].
1.3.2.7. Mùa vụ sinh sản
Mùa vụ sinh sản của cá bố mẹ cũng ảnh hưởng lớn đến hoạt lực của tinh trùng. Càng về cuối mùa sinh sản mật độ của tinh trùng càng giảm và khả năng hoạt lực cũng kém hơn. Vào cuối mùa sinh sản tinh trùng sẽ bị lão hóa, tinh trùng bị thay đổi hình thái học và giảm khả năng hoạt lực [19, 31, 104].