Chúng ta sử dụng ống hút tinh (1 đầu ống có gắn ống xilanh, 1 đầu ống không gắn ống xilanh) để thu tinh dịch cá dìa. Đầu tiên, chúng ta dùng khăn bông thấm sạch nước ở xung quanh lỗ sinh dục của cá đực. Tiếp theo, chúng ta đút đầu ống hút tinh không gắn ống xilanh vào lỗ sinh dục của cá đực (khoảng 2cm), còn đầu ống hút tinh có gắn ống xilanh thì hút tinh dịch ra. Tinh dịch trong ống xilanh được cho vào ống eppendorf 1,5 ml, đậy kĩ nắp ống rồi đưa vào thùng xốp đựng đá bào, vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm để tiến hành các phân tích và quan sát.
Hình 2.1. Cách lấy tinh dịch cá dìa 2.3. Đặc tính lý, hóa học của tinh dịch
Hình 2.2. Quy trình thí nghiệm xác định một số đặc tính lý, hóa học của tinh dịch cá
Cách tiến hành xác định một số đặc tính lý hóa của tinh trùng cá sau khi thu thập tinh dịch cá.
- Mật độ của tinh trùng được xác định bằng buồng đếm hồng cầu Haematocymetes (MARIENFIELD, Đức). Tinh dịch được pha loãng với nước cất trong ống enpendoff theo tỉ lệ 1:1000 (tinh dịch: dung dịch), sau đó lắc đều. Một giọt tinh dịch pha loãng được đặt trên buồng đếm hồng cầu (độ sâu 0,1mm với bên ngoài), đậy lamen lên. Sau 10 phút (thời gian tinh trùng trùng chết sẽ lắng xuống) quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần để đếm số lượng tinh trùng. Mật độ tinh trùng được tính theo công thức sau:
M = A x 4000 x R x 1000 80
Trong đó:
M: Mật độ tinh trùng trong 1µl tinh dịch (tế bào/µl). A: Tổng số tinh trùng trong 80 ô đếm.
R: Hệ số pha loãng tinh dịch. Mật độ của tinh trùng Đặc tính hóa sinh Thể tích của tinh trùng Tinh dịch cá dìa Ly tâm: 3 000 vòng khoảng 7 phút Độ quánh
4000: Nghịch đảo thể tích của 1 ô nhỏ. 80: Tổng số ô vuông nhỏ trong buồng đếm.
- Hoạt lực của tinh trùng: để đánh giá hoạt lực của tinh trùng, mẫu tinh dịch được pha loãng với nước biển nhân tạo ở tỉ lệ 1:100 (1µl tinh dịch: 99µl nước biển nhân tạo). Sau đó, hút 1 µl tinh dịch đã pha loãng cho lên lam kính và quan sát sự vận động của tinh trùng (phần trăm tinh trùng hoạt lực, thời gian tinh trùng hoạt lực) dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần. Kính hiển vi này được kết nối với máy tính thông qua camera giúp cho việc quan sát và đánh giá được thuận lợi. Các yếu tố nói trên được phân tích bằng phần mềm CASA. Các chỉ tiêu phân tích qua CASA bao gồm:
+ Phần trăm hoạt lực (%): được xác định bằng số tinh trùng hoạt lực so với số tinh trùng quan sát.
+ Thời gian hoạt lực (s): được tính từ lúc pha loãng cho đến 100% tinh trùng bất hoạt. - Thể tích của tinh dịch được xác định bằng ống eppendorf 1,5ml.
- Số lượng tinh trùng trên một đơn vị thể tích: được tính toán bằng thể tích của tinh dịch với mật độ của tinh trùng.
- Độ mặn được xác định bằng máy Portable refractometer., USA.
- Xác định pH, nồng độ thẩm thấu và các đặc tính hóa học: cho tinh dịch vào ống eppendorf 1,5 ml sau đó li tâm (3000 vòng/7 phút) (li tâm 3 lần). Sau khi li tâm tiến hành tách phần dịch tương ở phía trên rồi tiến hành xác định pH, nồng độ thẩm thấu.
- pH được xác định bằng bút đo pH Hanna instruments., Rumani.
- Nồng độ thẩm thấu xác định bằng máy Advandced Instruments Inc., USA.
- Độ quánh của tinh dịch được xác định bằng Hawksley micro-hematocrit reader. - Các đặc tính hóa học của tinh trùng được xác định bằng máy Fuji Dri- Chem 3500 (Fujifilm Co. Ltd., Japan).
2.4. Xác định các yếu tố tối ưu cho hoạt lực tinh trùng
Tinh trùng cá dìa
Tỷ lệ pha loãng tốt nhất cho tinh trùng Pha loãng: 1:50; 1:100; 1:150; 1:200
Hình 2.3. Quy trình xác định các yếu tố tối ưu cho hoạt lực của tinh trùng
- Đầu tiên, tiến hành quan sát hoạt lực của tinh trùng được pha loãng với nước biển nhân tạo ở các tỷ lệ 1:50, 1:100, 1:150, 1:200 để chọn ra tỉ lệ pha loãng tốt nhất cho hoạt lực tinh trùng và sau đó sử dụng tỉ lệ pha loãng tốt nhất này để tiến hành các quan sát tiếp theo như ảnh hưởng của pH, nồng độ thẩm thấu, nhiệt độ và cation lên hoạt lực của tinh trùng.
- Thành phần nước biển nhân tạo bao gồm: 27g NaCl; 0,5g KCl; 1,2g CaCl2; 4,6g MgCl2; 0,5g NaHCO3 được pha trong 1 lít nước cất với pH=7,8; nồng độ thẩm thấu 356±0,5 mOsm/kg. Tinh dịch và nước biển nhân tạo được pha theo các tỉ lệ 1:50; 1:100; 1:150; 1:200 trong ống eppendorf. Sau đó, 1µl tinh dịch của cá trong ống eppendorf pha loãng với nước biển nhân tạo được hút ra bằng micropipet. Tiếp theo, 1µl tinh dịch đã pha loãng được hút đưa lên lam kính quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần. Hoạt lực của tinh trùng bao gồm các thông số: phần trăm tinh trùng hoạt lực (PTHL) và thời gian hoạt lực (TGHL). Phần trăm hoạt lực được xác định bằng số tinh trùng hoạt lực so
với tổng số tinh trùng quan sát. Thời gian hoạt lực được tính từ lúc pha loãng cho đến 100% tinh trùng bất hoạt (đơn vị tính: giây).
+ Xác định ảnh hưởng của pH lên hoạt lực của tinh trùng: điều chỉnh tỷ lệ pha
loãng tốt nhất ở các mức pH khác nhau: 6, 7, 8, 9. pH của nước biển nhân tạo sử dụng trong thí nghiệm có pH=7,8. Muốn giảm pH dùng dung dịch HCl 0,1N còn tăng pH dùng dung dịch NaOH 0,1N. Sử dụng quy tắc đường chéo để tính lượng pH cần pha. Sau đó, dùng bút đo pH Hanna instruments để kiểm tra độ chính xác. Kiểm tra hoạt lực của tinh trùng.
+ Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt lực của tinh trùng: các mẫu tinh
dịch đã được pha loãng ở tỉ lệ tốt nhất điều chỉnh ở các nhiệt độ khác nhau: 20 oC, 25 oC, 30 oC, 35 oC. Điều chỉnh nhiệt độ ở các mức độ khác nhau bằng cách dùng đá giảm nhiệt độ. Sau đó kiểm tra hoạt lực tinh trùng (thời gian và phần trăm tinh trùng hoạt lực).
+ Xác định ảnh hưởng của nồng độ thẩm thấu lên hoạt lực của tinh trùng: sử
dụng dung dịch NaCl ở các mức nồng độ thẩm thấu: 200, 300, 400 và 500 mOsm/kg ở tỉ lệ pha loãng tối ưu (Theo công thức tính gián tiếp nồng độ thẩm thấu (OSMcalc = 2 x [Na+] + [glucose]/18 + [ure]/2.8) thì Na+ tham gia tạo nồng độ thẩm thấu nên sử dụng NaCl để điều chỉnh nồng độ thẩm thấu). Hoạt lực của tinh trùng ở quan sát này bao gồm các thông số: phần trăm tinh trùng hoạt lực, thời gian hoạt lực và thời gian trì hoãn. Thời gian trì hoãn là khoảng thời gian khi kích hoạt hoạt lực của tinh trùng, tinh trùng không hoạt lực ngay mà có thời gian làm quen với môi trường sau đó hoạt lực. Dung dịch ở các mức thẩm thấu trên được pha loãng với tỉ lệ tối ưu để quan sát ảnh hưởng của nồng độ thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng. Hoạt lực tinh trùng cũng được kiểm tra tương tự như trình bày ở trên.
+ Xác định ảnh hưởng của các ion (K+, Na+, Ca2+, Mg2+) lên hoạt lực của tinh
trùng: các mẫu tinh dịch được kích hoạt trong dung dịch chứa 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 M KCl,
NaCl, CaCl2, MgCl2. Đánh giá hoạt lực của tinh trùng.
- Dụng cụ để phân tích hoạt lực của tinh trùng là thiết bị có sự hỗ trợ của máy vi tính có gắn camera. Các file video được ghi lại và tiến hành phân tích chúng dựa vào phần mềm
CASA (Computer aided for sperm analysis). Trong phần này thì các thông số phần trăm tinh trùng hoạt lực và thời gian tinh trùng hoạt lực được sử dụng trong các quan sát này.
- Mỗi thí nghiệm được tiến hành quan sát 3 lần. Trung bình của mỗi quan sát là thông số kết quả cho nghiên cứu này.
2.5. Xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được xử lý trên phần mềm SPSS 16 và Excel 2003. Đặc tính lý, hóa học của tinh dịch dùng phân tích tương quan để thể hiện mối quan hệ. Tỷ lệ pha loãng, ảnh hưởng của pH, nồng độ thẩm thấu, nhiệt độ và các cation lên hoạt lực của tinh trùng được so sánh theo phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (one-way ANOVA). Sự sai khác giữa các nghiệm thức được so sánh theo phương pháp kiểm định Duncan, sai khác có ý nghĩa được xem xét khi (P<0,05). Các giá trị được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (Mean ± SD) hoặc giá trị trung bình ± sai số chuẩn (Mean ± SE).
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc tính lý, hóa học của tinh dịch cá dìa (Siganus guttatus Bloch, 1787)
Khối lượng, chiều dài và đặc tính lý học của tinh dịch cá dìa Siganus guttatus được trình bảy ở bảng 3.1 với khối lượng trung bình cá dìa đực là 403±14,33 gr và chiều dài thân cá không có sự chênh lệch nhiều so với chiều dài trung bình đo được là 27,74±0,59 cm. Thể tích tinh trùng thu thập của mỗi con cá dìa đực dao động từ 0,6 đến 1,2 ml và
trung bình là 0,86±0,22 ml. Theo kết quả của các nghiên cứu trước thì trung bình thể tích tinh dịch của cá dìa thấp hơn nhiều loài cá khác như: cá chẽm mõm nhọn (Psammoperca waigiensis) (1,28ml) [9], cá bơn (Scophthalmus maximus) (1,6ml) [117], cá tráp (Acanthopagrus schlegelii) (1,97ml) [24], cá hồi nâu (Salmo trutta caspius) (3,9ml) [15], cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus) (28,7ml) [5] nhưng cao hơn cá bò da (Thamnaconus modestus) (0,3 ml) [81], cá đù vàng (Larimichthys polyactis) (1,1ml) [83].
Bảng 3.1. Khối lượng, chiều dài, đặc tính lý học của tinh dịch cá dìa Siganus guttatus
Thông số Nhỏ nhất Lớn nhất TB ± SD Khối lượng (gr) Chiều dài (cm) Thể tích (ml/cá đực) Độ quánh (%) 381 26,9 0,6 85 420 28,5 1,2 95 403±14,33 27,74±0,59 0,86±0,22 91,71±3,55 Mật độ (x109 tb/ml) Phần trăm tt hoạt lực (%) Thời gian tt hoạt lực (s)
7,4 95 319 12 99 410 9,69±1,45 96,29±1,7 362,14±37,8 Số lượng tinh trùng (x109 tb/cá đực) pH Độ mặn (ppt) 5,1 8 28 12,2 8,25 32 7,8±2,78 30,56±1,61
Độ quánh tinh dịch cá dìa trung bình đạt 91,71±3,55%, giống với cá mú cọp
(Epinephelus fuscoguttatus) (92,3%) [5] nhưng thấp hơn cá tráp (Acanthopagrus schlegelii) (97,4%) [43], cá đối mục (Mugil cephalus) (96,7%) [28]. Độ quánh tinh dịch cá dìa cao hơn một số loài cá: ở cá hồi nâu (Salmo trutta caspius) (25,7%) [90], cá bơn vỉ (Paralichthys olivaceus) (60,2%) [128], cá nóc (Tetraodon pustulatus) (64,8%) [36], cá bơn (Platichthys stellatus) (72%) [64], cá chẽm mõm nhọn (Psammoperca waigiensis)
(87,7%) [9].
Mật độ tinh trùng cá dìa thấp (9,69±1,45×109 tb/ml) hơn so với nhiều loài cá biển khác. Ví dụ, mật độ tinh trùng cá chẽm mõm nhọn (Psammoperca waigiensis) (31,35×109
tb/ml), khoảng 23x109 tb/ml ở cá tráp (Acanthopagrus schlegelii) [43], cá bơn vỉ (Paralichthys olivaceus) (16x109 tb/ml) [101], cá đối mục (Mugil cephalus) (11,1x109 tb/ml) [36]. Mật độ tinh trùng cá dìa cao hơn mật độ tinh trùng của một số loài cá như: ở cá đù vàng (Larimichthys polyactis) (2,5×109 tb/ml) [81], cá bơn châu âu (Platichthys flesus) (2,7 x109/ml) [108].
Tinh trùng của hầu hết các loài cá không hoạt lực trong dịch tương, tinh trùng chỉ kích hoạt khi tiếp xúc với nước trong quá trình sinh sản tự nhiên hoặc trong điều kiện sinh sản nhân tạo. Các tinh trùng của cá dìa được kích hoạt ngay lập tức sau khi pha loãng và hoạt lực tinh trùng cũng được duy trì trong một thời gian 362,14±37,8s với phần trăm tinh trùng hoạt lực khá đồng đều dao động từ 95% đến 99%, trung bình 96,29±1,7%. Phần trăm và thời gian tinh trùng cá dìa hoạt lực cao hơn cá chẽm mõm nhọn (Psammoperca waigiensis) (95,8%; 218,58s) [9], cá hồi (Salmo trutta) (80,37%; 81,47s) [29] nhưng thời gian tinh trùng hoạt lực của cá dìa lại thấp hơn cá bơn (Scophthalmus maximus) (1020s) [115], cá bơn châu Âu (Platichthys flesus) (1320s) [108] và cá mú đen (Epinephelus malabaricus) (2400s) [58].
Giá trị pH trong dịch tương cá dìa dao động từ 8 - 8,25 và giá trị trung bình độ mặn 30,56±1,61 ppt, độ mặn trong dịch tương cá dìa gần giống với giá trị độ mặn của nước biển.
Bảng 3.2 Tương quan giữa các đặc tính lý học của tinh dịch cá dìa Siganus guttatus
Các thông số Khối
lượng Chiều dài Thể tích Độ quánh Mật độ
Khối lượng - - - - -
Thể tích 0,826* - - - - Độ quánh 0,131 - 0,104 0,531 - - Mật độ 0,348 0,082 0,642 0,895* - Số lượng tinh trùng 0,880* 0,684* 0,838* 0,558 0,641
*Tương quan P<0,05
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy có sự tương quan giữa các thành phần lý học tinh trùng cá dìa. Có sự tương quan giữa khối lượng với chiều dài, thể tích tinh dịch, số lượng tinh trùng cá dìa. Tương quan giữa chiều dài với số lượng tinh trùng. Tương quan giữa thể tích với số lượng tinh trùng. Tương quan giữa độ quánh và mật độ tinh trùng. Kết quả này góp phần khẳng định kết luận của nhiều tác giả là có thể sử dụng độ quánh của tinh dịch để đánh giá nhanh mật độ tinh trùng [16]. Thông tin mối tương quan giữa mật độ tinh trùng và độ quánh tinh dịch đã được nghiên cứu trên cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) [75], cá bơn (Hippoglossus sp) [123].
Bảng 3.3 Đặc tính hóa học của tinh dịch cá dìa Siganus guttatus
Đặc tính hóa học Thấp nhất Cao nhất TB±SD Na+ (mmol/l) 162,30 175,39 169,46±4,35 K+(mmol/l) 5,71 6,39 6,1±0,27 Cl-(mmol/l) 140,88 150,19 144,65±2,98 Mg2+(mmol/l) 13,25 17,83 15,55±1,67 Ca2+(mmol/l) 3,51 4,59 4,09±0,39 Tổng số protein (g/l) NDTT (mOsm/kg) 1,41 349 1,47 365 1,44±0,03 355±7
Kết quả nồng độ các ion có trong dịch tương cá dìa ở bảng 3.3 cho thấy thành phần dịch tương cá dìa giống với một số loài cá xương biển khác, thành phần dịch tương đều bao gồm năm ion Na+, K+, Cl-, Mg2+, Ca2+. Trong đó, Na+ và Cl- là hai ion hiện diện với nồng độ cao tương ứng với nồng độ (169,46±4,35 mmol/l) và (144,65±2,98 mmol/l). Kết quả hàm lượng ion Na+ ở cá dìa gần bằng với cá tráp (Acanthopagrus schlegelii) (169,5
mmol/l) [43] và cao hơn một số loài cá như cá đối mục (Mugil cephalus) (103,3 mmol/l) [121], cá đù vàng (Larimichthys polyactis) (148 mmol/l) [83], cá chẽm mõm nhọn (Psammoperca waigiensis) (154,45 mmol/l) [9], cá bò da (Thamnaconus modestus)
(164,0 mmol/l) [81] nhưng thấp hơn cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus) (176,72 mmol/l) [5], cá tầm Ba Tư (Acipenser persicus) (62,4 mmol/l) [17]. Các thành phần vô cơ có trong dịch tương là thành phần chủ yếu ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng cá. Sự hiện diện hay vắng mặt của chúng sẽ ảnh hưởng đến độ pH, nồng độ thẩm thấu và kích hoạt tinh trùng hoạt lực. Chúng ta biết rõ những thông số này thì có thể tạo ra chất bảo quản nhân tạo sử dụng bảo quản tinh trùng loài cá này ngắn hạn và dài hạn [13, 58, 93].
Hàm lượng protein trong dịch tương của cá thường thấp các loài động vật có xương sống [107]. Trong phân tích này, hàm lượng protein dịch tương cá dìa đã được xác định là 1,44±0,03 g/l. Kết quả hàm lượng protein trong dịch tương cá dìa cao hơn cá bò da (Thamnaconus modestus) (1g/l) [81], cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus) (1,28g/l) [5], thấp hơn cá đối mục (Mugil cephalus) (9g/l) [36], cá đù vàng (Larimichthys polyactis)
[83], cá chẽm mõm nhọn (Psammoperca waigiensis) (11,5 g/l) [9].
Giá trị trung bình của nồng độ thẩm thấu trong tinh dịch cá dìa là 355±7 mOsm/kg. Giá trị NDTT trong dịch tương cá dìa cao hơn so với một số loài cá biển và cá di cư. Giá trị NDTT trong tinh dịch cá chẽm mõm nhọn (Psammoperca waigiensis) là 346,37 (mOsm/kg) [9], cá đù vàng (Larimichthys polyactis) (342,5 mOsm/kg) [83], cá bơn vỉ
(Paralichthys olivaceus) (334,3 mOsm/kg) [28], cá bò da (Thamnaconus modestus)
(322,8 mOsm/kg) [81], cá tầm Ba Tư (Acipenser persicus) (82,6 mOsm/kg) [53]. Giá trị NDTT trong dịch tương cá dìa thấp hơn cá đối mục (Mugil cephalus) (370 mOsm/kg) [36], cá tuyết Đại Tây Dương (Gadus morhua) (400 - 417 mOsm/kg) [88]. Nồng độ thẩm thấu trong dịch tương cao hơn 300 mOsm/kg đủ để ngăn chặn khả năng vận động của tinh trùng trong dịch tương. Cá dìa sống trong môi trường nước mặn nên thành phần lý học trong dịch tương cá gần giống với thành phần lý học có trong nước biển.
Các thành phần vô cơ có trong dịch tương là thành phần chủ yếu ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng cá. Sự hiện diện hay vắng mặt của chúng sẽ ảnh hưởng đến độ pH, nồng độ
thẩm thấu và kích hoạt tinh trùng hoạt lực. Chúng ta biết rõ những thông số này thì có thể tạo ra chất bảo quản nhân tạo sử dụng bảo quản tinh trùng loài cá này ngắn hạn và dài hạn [58].
Bảng 3.1 Tương quan giữa các đặc tính hóa học cá dìa Siganus guttatus
Thông số Na+ K+ Cl- Mg2+ Ca2+ Protein Na+ - K+ 0,851* - Cl- 0,367 0,238 - Mg2+ - 0,270 - 0,102 - 0,287 - Ca2+ 0,598 0,301 0,028 0,073 - Protein - 0,896* - 0,788* - 0,221 0,592 - 0,421 - NDTT - 0,605 - 0,756* 0,042 0,213 - 0,485 0,697* *Tương quan P<0,05
Sự tương quan giữa các đặc tính hóa sinh trong dịch tương cá dìa được thể hiện trong bảng 3.4. Có sự tương quan giữa ion Na+ với ion K+ và tổng số protein, ion K+ với tổng số protein và nồng độ thẩm thấu, tổng số protein với nồng độ thẩm thấu. Sự tương quan giữa Na+ và K+ cũng được tìm thấy tại cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus). Xác định được mối tương quan giữa các thành phần cho phép chúng ta hiểu rõ hơn về sự thay đổi đặc tính sinh lý, sinh hóa của tinh trùng cá dìa và cũng giải thích tại sao tinh trùng hầu hết các loài cá biển cũng như cá dìa đều không hoạt động trong tinh dịch hay trong buồng sẹ mà chúng chỉ hoạt động khi được phóng thích vào môi trường thụ tinh.