2.2.1. Mẫu tu hài
Mẫu tu hài để phân lập vi khuẩnđược thu tại các trại nuôi thuộc vịnh Nha Trang và Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa. Tại nơi thu mẫu, mẫu được cắt bỏ những phần không cần thiết và thu lấy phần cơ thịt bằng dao, panh vô trùng. Sau đó mẫu được đưa vào nước muối sinh lý vô trùng, rồi vận chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập vi khuẩn tổng số.
Bảng 2.1. Thu mẫu Tu hài phân lập vi khuẩn biển
STT Ngày phân lập Địa điểm thu mẫu Số lượng mẫu (con)
1 27/2/2012 Vịnh Nha Trang 3 2 24/7/2012 Vịnh Nha Trang 3 3 9/10/2012 Vịnh Cam Ranh 3
2.2.2. Chủng vi khuẩn chỉ thị
Các chủng vi khuẩn chỉ thị được sử dụng để thử hoạt tính của các chủng vi khuẩn phân lập được. Các chủng này bao gồm các chủng Enterococcus faecalis B1.1, Vibrio parahaemolyticus C1 và Vibrio alginolyticus V3.3 được lấy từ bộ sưu tập vi sinh vật của
Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang.
Các chủng trên được nuôi cấy trên môi trường TSB, hoặc TCBS, bổ sung 1,5 % NaCl, lắc 180 vòng/phút, ở 37oC.
2.2.3. Hóa chất, môi trường và thuốc thử
a) Môi trường nuôi cấy lỏng TSB (Trypton Soy Broth)
Trypticase pepton: 17 g Phytone pepton :3 g NaCl : 5 g K2HPO4: 2,5 g Glucose : 2,5 g Nước cất: 1 L pH (ở 25oC): 7,3 ± 0,2
Hòa tan 30 g môi trường TSB tổng hợp trong 1000 ml nước cất, chuẩn pH, sau đó đổ môi trường vào các bình tam giác, làm nút bông và bọc giấy bạc, hấp khử trùng ở 121oC trong vòng 15 phút.
b) Môi trường thạch nuôi cấy vi khuẩn tổng số TSA (Trypton soy agar) Môi trường TSA được pha từ môi trường TSB có bổ sung thêm 1,5 % agar. c) Môi trường thạch nuôi cấy TCBS ( Thiosulphate Citrate Bile salts Sucrose) Peptone special : 10 g/l Yeast extrat: 5 g/l
Sodium thiosulphate: 10 g/l Sodium citrate: 10 g/l Sodium cholate: 3g/l Oxgall: 5 g/l
Sucrose: 20 g/l Sodium chloride 10 g/l Feric citrate: 1 g/l Bromo thymol blue: 0,04 g/l Thymol blue: 0,04 g/l Agar: 15 g/l
pH (250C): 8,8 ± 0,2
Hòa tan 89 g môi trường TCBS tổng hợp trong 1000 ml nước tiệt trùng vào bình tam giác sạch. Sau đó làm nút bông, bọc giấy bạc và đun sôi đến khi agar trong môi trường tan hết.
d) Dung dịch nước muối sinh lý
Hòa tan 8,5 g NaCl trong 1 L nước cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút.
e) Thuốc nhuộm Crytal Violet Tím violet : 1 g Rượu ethylic : 1 g Phenol tinh thể : 2 g Nước cất : 100 ml
Hòa tan 1g tím violet vào trong 10 ml cồn (dung dịch 1) Hòa tan 2g phenol tinh thể vào 10 ml nước cất (dung dịch 2)
Trộn chung dung dịch 1 và 2 lại với nhau ta có dung dịch thuốc nhuộm tím violet.
f) Thuốc nhuộm Lugol Iod tinh thể : 1 g KI : 2 g Nước cất : 200 ml
Hòa tan iod vào nước cất, sau đó cho KI vào, bảo quản trong lọ tối màu. g) Thuốc nhuộm Fuchsin
Fuschin kiềm : 1 g Rượu ethylic 95%: 10 ml Phenol tinh thể : 5 g Nước cất : 100 ml
Hòa tan Fuchsin vào trong 10 ml cồn 95% (dung dịch 1) Hòa tan phenol tinh thể vào 100 ml nước cất (dung dịch 2). Trộn đều dung dịch 1 và 2 đem lọc, ta có thuốc nhuộm Fuchsin h) Các enzyme:
Một số enzyme được sử dụng để xác định bản chất hóa học của dịch bacteriocin, bao gồm: α- amylase (Sigma), α – catalase (Sigma), α- chymotrypsin (Sigma), Proteinase K (Sigma), Lipase (Sigma). 2.2.4. Thiết bị chuyên dụng
- Cân phân tích (Shimadzu, Nhật).
- Máy ly tâm (Eppendof Mikrol 120, Đức). - Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam).
- Kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic BA 300, Mỹ). - Máy quang phổ khả kiến (Genesys 20 Thermo) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Máy lắc vòng (GFL 3005, Đức) - Tủ sấy (Binder, Đức)
- Nồi hấp thanh trùng autoclave (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan). - Lò vi sóng (Panasonic, Hàn Quốc).
- Tủ ấm - Bể ổn nhiệt.
2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phân lập vi khuẩn 2.3.1. Phân lập vi khuẩn
Vi khuẩn tổng số sẽ được phân lập bằng phương pháp đĩa thạch dinh dưỡng. Mẫu mô tu hài được cân, đồng nhất, sau đó tiến hành pha loãng.
Tiến hành pha loãng mẫu theo các nồng độ khác nhau bằng nước muối sinh lý 0,85 %. Chuẩn bị một dãy ống nghiệm có chứa 9 ml nước muối sinh lý, sau đó lấy 1 ml dịch mẫu cần phân lập cho vào ống thứ nhất. Lắc đều, lấy 1 ml mẫu ở ống thứ nhất (10-1) chuyển sang ống nghiệm thứ 2 (10-2). Làm tiếp tục cho đến ống nghiệm có độ pha loãng là 10-6. Ở mỗi ống nghiệm, lấy 100 µl và trải đều lên đĩa thạch chứa môi trường TSB có bổ sung 1,5% thạch agar và 1,5% NaCl. Dùng que trang bằng thủy tinh dàn đều trên mặt cho đến khi mặt thạch khô. Úp ngược đĩa peptri và đem nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong vòng 24 giờ. Sau đó khuẩn lạc đại diện sẽ được thu tách và thuần khiết.
Trong quá trình phân lập vi khuẩn, ngay sau khi cấy mẫu và ủ ở tủ ấm 37oC trong 24 - 36 giờ các khuẩn lạc sẽ mọc trên thạch đĩa, lúc này ta tiến hành đếm tổng số khuẩn lạc trên các đĩa này.Chọn các đĩa petri có từ 25 đến 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri có độ pha loãng khác nhau cần tuân thủ theo một quy luật hợp lý: độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc đếm được trên đĩa petri phải càng ít. Nếu kết quả không hợp lý, cần thực hiện lại các thí nghiệm.
Công thức tính (CFU g) d C C N / 2 2 1+ = Trong đó:
N – số khuẩn lạc có trong 1 g mẫu ban đầu
C1, C2 - số khuẩn lạc đếm được trên 2 đĩa petri ở độ pha loãng đã chọn d – hệ số pha loãng mẫu
2.3.2. Nuôi cấy và bảo quản chủng vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn phân lập được nuôi trên môi trường TSB (dịch lỏng), TSA (thạch) hoặc TCBS (thạch) theo mô tả của Trần Linh Thước [8]. Các chủng vi khuẩn sau khi thuần khiết được bảo quản cho các thí nghiệm tiếp theo. Cách bảo quản như sau: nuôi cấy vi khuẩn trong các bình tam giác chứa môi trường TSB đến khi mật độ quang OD600 đo được nằm trong khoảng 0,8 – 1 thì đem lưu giữ. Các chủng vi khuẩn
được giữ trong các ống eppendorf 1,5 ml có bổ sung thêm 30% glycerol. Voltex nhẹ cho đều hỗn hợp sau đó bảo quản ở -80oC.
2.3.3. Xác định hoạt tính sinh bacteriocin 2.3.3.1. Xác định hoạt tính kháng khuẩn 2.3.3.1. Xác định hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt tính bacteriocin được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng giữa vi khuẩn thử nghiệm và vi khuẩn chỉ thị (vi khuẩn đích).
Các chủng cần kiểm tra tính kháng sau khi được bảo quản ở -80oC cần được rã đông rồi hút 1 ml dịch vi khuẩn cho vào các bình tam giác môi trường TSB đã chuẩn bị trước đó, lắc qua đêm ở 180 vòng/ phút [66]. Sau đó, đo OD600 ban đầu (OD1), OD1 nằm trong khoảng 1 - 2 thì chuyển sang nuôi cấy lần 2. Mức OD600 ban đầu lần hai (OD2) được đưa về mức 0,06. Tiếp tục nuôi cho đến khi OD600 là 0,8 - 1.
Hút 10 ml dịch vi khuẩn vào ống falcon để ly tâm (6000 v/p, 30 phút, 4oC). Sau đó thu dịch nổi, loại bỏ cặn tế bào và trung hòa pH tới 7,0 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc HCl 1N. Dịch nổi này được coi như là dịch bacteriocin thô và kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn như sau:
- Đổ 15 ml môi trường nuôi vào đĩa peptri vô trùng, để thạch đông. - Cấy trang 100 µl vi khuẩn chỉ thị lên bề mặt đĩa thạch.
- Đục các giếng có đường kính 7 mm trên đĩa thạch.
- Nhỏ 100 µl dịch bacteriocin của vi khuẩn thử nghiệm vào trong giếng.
- Sau 24 giờ hoạt tính kháng khuẩn được xác định theo kích thước của vòng vô khuẩn. Nếu xuất hiện vòng vô khuẩn có nghĩa mẫu có hoạt tính kháng khuẩn và ngược lại nếu không xuất hiện vòng vô khuẩn thì mẫu không có hoạt tính [97].
Hoạt tính kháng khuẩn được biểu thị bằng kích thước vòng kháng và được tính như sau :
dkk = D - dlỗ Trong đó :
- dkk: đường kính vòng kháng khuẩn (mm).
- D : đường kính vòng phân giải + đường kính lỗ thạch (mm). - dlỗ: đường kính lỗ thạch (mm).
2.3.3.2. Xác định bản chất của chất kháng khuẩn
Để khẳng định mẫu là bacteriocin hoặc BLIS cần xác định bản chất protein của mẫu bằng cách xử lý với các enzyme proteinase K và trypsin.
Trước tiên xử lý dịch thô bacteriocin bằng enzyme catalase sao cho tỉ lệ enzyme/dịch thô đạt nồng độ cuối cùng là 1 mg/ml, thời gian xử lý 30 phút, ở nhiệt độ phòng (32oC). Bước này có mục đích xác định ảnh hưởng của H2O2 tới khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin [97]. Dịch thô sau khi được xử lý với enzyme cactalase thì tiếp tục được xử lý với các enzyme trypsin và proteinase K.
Các loại enzyme (đã được pha sẵn trước đó với nồng độ 20 mg/ml) sẽ được bổ sung vào dịch bacteriocin sao cho tỷ lệ enzyme/dịch bacteriocin thô của vi khuẩn đạt nồng độ cuối cùng là 1 mg/ml.
Mẫu xử lý proteinase K và trypsin ủ trong 3 giờ ở 50oC. Sau đó đem bất hoạt enzyme ở 4oC trong vòng 10 phút. Sau khi xử lý enzyme, các dịch bacteriocin được nhỏ vào các giếng trên đĩa thạch. Kết quả được kiểm tra dựa trên kích thước vòng kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch như đã mô tả ở trên (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.4. Xác định một số tính chất của dịch bacteriocin thô 2.3.4.1. Thử độ bền với enzyme của dịch bacteriocin thô 2.3.4.1. Thử độ bền với enzyme của dịch bacteriocin thô
Phương pháp thực hiện tương tự như mục 2.3.3.2 đã trình bày ở trên. Tuy nhiên, thời gian và điệu kiện ủ enzyme được thực hiện như sau:
- Mẫu xử lý với α-amylase ở nồng độ cuối cùng là 1 mg/ml, sau đó ủ ở 20oC trong 2 giờ;
- Mẫu xử lý với lipase ở nồng độ cuối cùng là 1000U, ủ ở 37oC trong 2 giờ. Sau khi xử lý enzyme, các dịch bacteriocin được nhỏ vào các giếng trên đĩa thạch. Kết quả được kiểm tra dựa trên kích thước vòng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị Enterococcus faecalis B1.1 bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Đối chứng 1 là dịch bacteriocin thô không xử lý enzyme, ở nhiệt phòng (32oC), và đối chứng 2 là dịch bacteriocin xử lý với catalase. Sau 12÷16 giờ kiểm tra sự tạo thành vòng kháng và đo đường kính các vòng kháng khuẩn.
2.3.4.2. Xác định độ bền với nhiệt của dịch bacteriocin thô
Nuôi cấy vi khuẩn và tiến hành thu dịch bacteriocin thô (các thao tác thu dịch nuôi đã mô tả trước đó), chuẩn độ pH về giá trị 7. Hút lần lượt ra các ống nghiệm đã
sấy tiệt trùng, mỗi ống nghiệm 5 ml đem đi xử lý ở các nhiệt độ sau: 60oC, 100oC bằng cách ủ ở bể ổn nhiệt trong 30 phút và 121oC ở nồi hấp trong vòng 15 phút. Sau khi xử lý, mẫu được ủ ở 4oC (trong 10 phút).
Mẫu đối chứng dương là dịch bacteriocin thô không xử lý nhiệt, để ở nhiệt độ phòng (32oC, 30 phút). Sau khi xử lý nhiệt, dịch nuôi được đem kiểm tra hoạt tính vòng kháng khuẩn như đã trình bày ở trên.
2.3.4.3. Xác định độ bền với pH của dịch bacteriocin thô
Các thao tác nuôi cấy và chuẩn bị dịch bacteriocin tương tự như trên, hút lần lượt ra các ống nghiệm đã sấy tiệt trùng có ghi sẵn các giá trị pH cần chuẩn, mỗi ống 10 ml dịch.
Chuẩn độ pH ở các thang 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12 bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N, đem ủ trong tủ ấm 37oC trong vòng 30 phút. Cuối cùng chuẩn độ pH về giá trị 7.
Sau đó, dịch nuôi được đem kiểm tra hoạt tính vòng kháng khuẩn như đã trình bày ở trên.
2.3.5. Xác định hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn 2.3.5.1. Xác định hình thái khuẩn lạc 2.3.5.1. Xác định hình thái khuẩn lạc
Quan sát và mô tả hình dạng kích thước và màu sắc khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn, sử dụng phương pháp cấy ria và cấy điểm chủng vi sinh vật trên môi trường đĩa thạch tương ứng.
Hoạt hóa chủng vi khuẩn gốc được giữ trong glycerol bằng cách hút 1 ml dịch vi khuẩnnuôi cấy trong môi trường TSB, ở điều kiện 37oC trong 16÷24 giờ. Dùng que cấy ria, lấy một vòng dịch vi khuẩn đã hoạt hóa cấy ria và cấy điểm trên môi trường thạch đĩa TSA, nuôi cấy ở điều kiện như trên. Quan sát và mô tả hình thái, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc sau 18÷24 giờ.
2.3.5.2. Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn
Hình thái tế bào được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram như sau: Tế bào vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường TSB có bổ sung 1,5% NaCl trong vòng 24 giờ, sau đó được đem làm tiêu bản nhuộm Gram. Sau khi cố định vết bôi, nhuộm bằng dung dịch Crytal violet trong trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhuộm lại bằng dung dịch Glucol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhỏ dịch tẩy màu (cồn 90o), giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô. Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 1 phút, rửa nước, để khô trong không khí. Soi dưới kính hiển
vi quang học (vật kính dầu 100x), vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng đỏ.
2.3.6. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rDNA và rpoB rDNA và rpoB
Tách chiết DNA hệ gen
Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường TSB ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 2 phút ở 4oC để thu tế bào [61]. DNA tổng số được tách chiết bằng bộ kit Wizard® SV Genomic DNA System (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sau đó bảo quản ở -20oC.
Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA bằng kỹ thuật PCR
Đoạn gen 16S rDNA của vi khuẩn được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi tương ứng được tổng hợp bởi IDT (Mỹ) có trình tự như sau:
16S-27F 5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3' 16S-1492R 5'ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT 3' [61].
Phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 50 µl với các thành phần ở nồng độ cuối cùng như sau: DNA (2-20 ng), mỗi mồi (0,1 µM), dNTP (0,1 mM mỗi loại), MgCl2 (2 mM), Taq polymerase (1,25 U) và đệm Tag (1X). Chu kì nhiệt của phản ứng bao gồm biến tính ban đầu ở 94oC trong 5 phút; 35 chu kì của 94oC trong 1 phút, 62oC trong 1 phút và 72oC trong 1 phút 30’; và cuối cùng kết thúc ở 72oC trong 7 phút. Qui trình và nồng độ hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR được trình bày cụ thể trong phụ lục 1. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1-1,5% trong đệm TBE 0,5X, sau đó được nhuộm với ethidium bromide và đọc kết quả trên máy chụp ảnh gel (Biorad).
Khuếch đại đoạn gen rpoB bằng kỹ thuật PCR
Đoạn gen rpoB của vi khuẩn được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi tương ứng được tổng hợp bởi IDT (Mỹ) có trình tự như sau:
CM7 (5’-AACCAGTTCCGCGTTGGCCTGG-3’) CM31b (5’-CCTGAACAACACGCTCGGA-3’), [65]
Phản ứng PCR được tiến hành tương tự như trên với ngoại trừ là nhiệt độ trong chu trình nhiệt được thiết kế như sau: nhiệt độ biến tính ban đầu ở 94oC trong 3 phút; 35 chu kì của 94oC trong 30 giây, 52oC trong 30 giây và 72oC trong 1 phút 20’; và cuối cùng kết thúc ở 72oC trong 7 phút. Qui trình và nồng độ hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR được trình bày cụ thể trong phụ lục 2.
Giải và phân tích trình tự (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PCR clean up system (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sử dụng làm khuôn trực tiếp cho phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye Terminator v. 3.1, Applied Biosystems) với các cặp mồi 16S-27F/16S-1492R theo chương trình nhiệt như sau: 96°C trong 20 giây, 50°C trong 20 giây và 60°C trong 4 phút. Sản phẩm phản ứng được phân tích trên máy phân tích trình tự tự động ABI Prism 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems).
2.3.7. Phân tích quan hệ phát sinh loài
Các trình tự DNA của các chủng vi khuẩn và các trình tự tham chiếu có sẵn trên GenBank sẽ được sử dụng cho việc phân tích trình tự trên NCBI (National Center for