Hình 2.1. Sơ đồ các nội dung nghiên cứu chính của luận văn
Kết luận Nghiên cứu tính chất
hóa lý của bacteriocin (độ bền nhiệt, pH, enzyme)
Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh bacteriocin
Xác định hoạt tính kháng khuẩn Xác định bản chất của chất kháng khuẩn
Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học phân tử, định danh, mối quan hệ phát sinh loài
Bảo quản
Phân lập vi khuẩn tổng số Mẫu tu hài
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn từ thịt tu hài
Tổng số vi khuẩn qua 3 lần phân lập được thể hiện ở Bảng 3.1. Từ Bảng 3.1 cho thấy trung bình mật độ vi khuẩn của ba lần phân lập là 7,9 x 104 CFU/g. Dựa vào hình thái, màu sắc khuẩn lạc khác nhau chúng tôi đã phân lập được 128 chủng vi khuẩn. Sau khi thuần khiết, các chủng được bảo quản trong ống eppendorf có bổ sung 30 % glycerol so với dịch vi khuẩn. Kết quả được minh họa trên hình 3.1.
Bảng 3.1. Số chủng vi khuẩn ở các lần phân lập
STT Ngày phân lập Vi khuẩntổng số (CFU/g) Số chủng phân lập (Kí hiệu chủng) 1 27/2/2012 1 x 105 20 (X1.1 - X1.20) 2 24/7/2012 1,23 x 105 50 (H1 –H50) 3 9/10/2012 1,4 x 104 58 (H51 – H58)
Hình 3.1. Khuẩn lạc trên đĩa thạch ở độ pha loãng 10-6 sau 24 giờ nuôi cấy
Như vậy, từ 9 mẫu tu hài (Lutraria philippinarum) thu từ vịnh Nha Trang và Cam Ranh, chúng tôi đã phân lập được 128 chủng vi khuẩn biển.
3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn
Việc xác định hoạt tính đối kháng của vi khuẩn với một chủng vi khuẩn có hại nào đó là rất cần thiết trong tuyển chọn chủng sinh bacteriocin. Tính đối kháng thể hiện qua việc dịch nuôi của vi khuẩn khuếch tán vào môi trường và gây ức chế chủng chỉ thị dẫn đến xuất hiện vòng kháng khuẩn trên đĩa thạch.
Mục tiêu của đề tài là tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh bacteriocin nhằm định hướng sản xuất thuốc phòng trừ dịch bệnh trong NTTS, do đó chúng tôi tập trung khảo sát tính kháng khuẩn của vi khuẩn biển lên một số chủng chỉ thị có hại cho thực phẩm và thủy sản (Entercoccus faecalis. B1.1, Vibrio alginolyticus V3.3, Vibrio
parahaemolyticus C1). Ba chủng vi khuẩn đích này được sử dụng để kiểm tra tính đối kháng của 128 chủng vi khuẩn phân lập được. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng phân lập đối với ba chủng vi khuẩn đích Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm) STT Ký hiệu chủng V. alginoticus V3.3 V. parahaemolyticus C1 Entercoccus faecalis. B1.1 1 X1.4 9,5 ± 0,5 - - 2 X1.5 10,5 ± 0,5 - - 3 X1.9 7,5 ± 0,5 - - 4 X1.10 - 10,5 ± 0.5 - 5 X1.11 7,5 ± 0,5 - - 6 H1 - - 7,5 ± 0,5 7 H2 7 ± 1 - - 8 H5 5 ± 0,5 - - 9 H7 - - 12 ± 1 10 H8 8,5 ± 0,5 - 16 ± 1 11 H9 9 ± 1 - 15,5 ± 0,5 12 H15 6,5 ± 0,5 - - 13 H18 10 - 16 ± 1 14 H21 6,5 ± 0,5 - - 15 H50 9 ± 2 6,5 ± 0,5 - 16 H51 8 ± 1 - 10,5 ± 0,5 17 H53 11 ± 1 - 18 H58 - - 13,5 ± 0,5 19 H61 11,5 ± 0,5 - 11,5 ± 0,5 20 H64 - - 8 21 H73 6 ± 1 - - 22 H74 - - 6 ± 1 23 H76 - - 15 ± 1 24 H77 9,5 ± 0,5 - 17,5 ± 0,5 25 H78 - - 19 26 H108 9 ± 1 - 16 ± 1
Kết quả từ Bảng 3.2 cho thấy trong tổng số 128 chủng phân lập được có 26 chủng vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn với ít nhất một chủng vi khuẩn đích, chiếm 20,3 %. Cụ thể là 14 chủng kháng được Entercoccus faecalis B1.1, 19 chủng kháng
được Vibrio alginolyticus V3.3, và 2 chủng kháng Vibrio parahaemolyticus C1. Trong đó, có 8 chủng (H7, H8, H9, H18, H51, H58, H77, H108) cùng kháng hai chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus V3.3 và Entercoccus faecalis B1.1; nhưng chỉ có một chủng H50 kháng được V. alginolyticus V3.3 và V. parahaemolyticus C1.
Nếu chia theo lần phân lập thì có 5 chủng thuộc lần phân lập thứ nhất, 10 chủng ở lần phân lập thứ hai và 11 chủng trong lần phân lập thứ ba chiếm lần lượt là 19,23%, 38,46 %, và 42,3 % (Hình 3.2). Điều này cho thấy rằng, ở cả vịnh Nha Trang và vịnh Cam Ranh đều có thể phân lập được các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn.
Hình 3.2. Tỉ lệ các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng với vi khuẩn chỉ thị ở ba lần phân lập
Từ Bảng 3.2 và các Hình 3.3, 3.4, 3.5 cho thấy, một số chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, có đường kính từ 15 mm trở lên, như là H1, H9, H77, H78, H108. Ngược lại, có một số chủng có đường kính vòng khuẩn chỉ là 5 - 6 mm (H5, H73, H74).
Nói tóm lại, trong tổng số 128 chủng phân lập được, chúng tôi đã tìm ra 26 chủng có hoạt tính kháng khuẩn với ít nhất một trong ba chủng chỉ thị có tiềm năng gây bệnh trong thực phẩm, thủy sản (Enterococcus faecalis B1.1, Vibrio alginolyticus V3.3 và V. parahaemolyticus C1).
Hình 3.3. Vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn phân lập đối với chủng chỉ thị Vibrio alginolyticus V3.3 trên môi trường TCBS
Hình 3.4. Vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn phân lập đối với chủng chỉ thị Entercoccusfaecalis B1.1 trên môi trường TSA
Hình 3.5. Vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn phân lập đối với chủng chỉ thị V. parahaemolyticus C1 trên môi trường TCBS 3.3. Xác định bản chất bacteriocin của các chất kháng khuẩn
Quá trình thử tính kháng của 26 chủng vi khuẩn được lặp lại tối thiểu ba lần, trong đó chúng tôi chọn ra 19 chủng có hoạt tính kháng mạnh, ổn định, và đại diện cho từng vi khuẩn chỉ thị được chọn để kiểm tra bản chất của chất kháng khuẩn bằng cách xử lý dịch nuôi vi khuẩn với trypsin và proteinase K. Cụ thể, có 8 chủng (H7, H8, H9, H18, H51, H61, H77 và H108) cùng kháng với Entercoccus faecalis B1.1 và Vibrio
alginolyticus V3.3; chủng H50 cùng kháng V. alginolyticus V3.3 và V. parahaemolyticus C1; 6 chủng (H1, H58, H64, H74, H78) kháng Entercoccus faecalis (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
B1.1; 3 chủng (X1.4, X1.5) kháng V. alginolyticus V3.3 và chủng X1.10 kháng V. parahaemolyticus C1.
Kết quả vòng kháng khuẩn sau khi xử lý với enzyme trypsin và proteinase K của dịch bacteriocin thô của 19 chủng trên được trình bày tại Bảng 3.3.
Kết quả từ Bảng 3.3 và minh họa trong Hình 3.6, 3.7 về ảnh hưởng của các loại enzyme đến hoạt tính kháng cho thấy, sau khi xử lý với enzyme proteinase K và trypsin, dịch chiết ngoại bào của các chủng vi khuẩn có tính kháng với Entercoccus faecalis B1.1 đã bị mất hoàn toàn tính kháng khuẩn đến các loại vi khuẩn đích. Trong
khi đó mẫu đối chứng vẫn xuất hiện vòng kháng khuẩn (Hình 3.6). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Balcázar và cộng sự [15] khi tiến hành xử lý dịch ngoại bào của 13 chủng phân lập từ cá ngựa (Hippocampus guttulatus) với hai loại enzyme
trypsin và proteinase K. Trong đó, dịch ngoài bào của 3 chủng (HG – 3F, HG – 12F, HG – 14F) bị mất hoạt tính khi xử lý bằng proteinase K, trong khi đó 2 chủng (HG – 12F, HG – 14F) bị mất hoạt tính khi xử lý bằng trypsin.
Hình 3.6. Vòng kháng khuẩn của dịch bacteriocin của chủng H18 và H76 sau khi xử lý với proteinase K và trypsin, vi khuẩn chỉ thị là Entercoccus
faecalis B1.1
Theo định nghĩa bacteriocin là những hợp chất có bản chất là protein do vi khuẩn sinh tổng hợp và thường có khả năng ức chế các loài vi khuẩn có họ hàng gần với chủng sản sinh ra nó [91]. Bản thân vi khuẩn sản sinh bacteriocin có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Bacteriocin còn bị thủy phân bởi các enzyme như trypsin, pepsin, … Điều đó chứng tỏ các chất kháng khuẩn của các chủng tuyển chọn được là bacteriocin, có bản chất là protein.
Trong nghiên cứu này, có 19/ 128 chủng vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin hoặc chất tương tự bacteriocin, chiếm 14,8%. So với những nghiên cứu trước đây về vi khuẩn sinh bacteriocin thì kết quả này rất khả quan. Theo nghiên cứu của McCall và cộng sự [62] về bacteriocin từ các vi khuẩn biển cho thấy chỉ có 5% trong số 795 chủng có khả năng sinh bacteriocin. Hay Wilson và cộng sự [103] chỉ phân lập được 10% vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin từ cảng Sydney, Australia.
Tuy nhiên, hầu hết dịch chiết ngoại bào có khả năng kháng chủng V. alginolyticus V3.3 và V. parahaemolyticus C1 (chủng X1.10) chỉ bị mất hoạt tính khi
khuẩn trong và rộng hơn so với các mẫu đối chứng (Hình 3.7). Điều này có thể giải thích là do các chủng chỉ thị này mẫn cảm với enzyme proteinase K.
(A) (B)
Hình 3.7. Vòng kháng khuẩn của dịch bacteriocin của hai chủng H18, X1.10 sau khi xử lý với trypsin và proteinase K, vi khuẩn chỉ thị là V.
alginolyticus V3.3 (A) và V. parahaemolyticus C1 (B)
Khi so sánh kết quả vòng kháng của các chủng thí nghiệm cho thấy chúng thường kháng với Entercoccus faecalis B1.1 mạnh hơn so với hai chủng chị thị còn
lại. Các chủng kháng B1.1 có đường kính vòng kháng khuẩn >9 (ngoại trừ H1, H7, H8 có đường kính <9). Các chủng kháng với V. alginolyticus V3.3 có vòng kháng từ 6,5 – 13 mm. Hai chủng kháng với V. parahaemolyticus C1 có vòng kháng lần lượt là 9 mm (X1.10) và 11 mm (H50).
Do hạn chế về thời gian, phương tiện và kinh phí nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn 6 chủng H9, H18, H51, H61, H77, H108 có vòng kháng rộng và ổn định nhất đối với Entercoccus faecalis B1.1 trong các lần lặp để nghiên cứu tiếp.
Như vậy, chỉ có 19/26 chủng bị mất hoạt tính kháng khuẩn sau khi xử lý với proteinase K và trypsin, chứng tỏ các chủng này có khả năng sinh bacteriocin hoặc chất tương tự bacteriocin. Trong đó chỉ có 6 chủng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh và ổn định nhất, đó là: H9, H18, H51, H61, H77 và H108. Các chủng này sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của trypsin và proteinase K đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô của các chủng tuyển chọn
Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm)
Entercoccus faecalis B1.1 Vibrio. alginolyticus V3.3 V. parahaemolyticus C1
TT Chủng
ĐC1 ĐC2 EZ-T EZ-PK ĐC1 ĐC2 EZ-T EZ-PK ĐC1 ĐC2 EZ-T EZ-PK
1 X1.4 4±2 4±2 0 17 2 X1.5 4,5±2,5 6,5±2,5 0 17±0 3 X1.10 9±0 6,5±2,5 0 19±0 4 H1 5±3 6,5±4,5 0 0 5 H7 7±0 8,5±1,5 0 0 + + 0 + 6 H8 7 7 0 0 + + 0 4,5±1,5 7 H9 19,5±1,5 18±3 0 0 9±0 10,5±0,5 0 + 8 H18 24,5±3,5 22,5±2,5 0 0 7±0 8±1 0 18,5±0,5 9 H50 9 10 0 8 11 12 0 0 10 H51 22±1 17±1 0 0 7±1 9±0 0 19,5±0,5 11 H53 12,5±0,5 11±0 0 18,5±0,5 12 H58 12,5±0,5 11,5±0,5 0 0 13 H61 22±1 20±3 0 0 11±1 10,5±1,5 0 18,5±0.5 14 H64 12±1 9,5±0,5 0 0 15 H74 10,5±2,5 9,5±0,5 0 0 16 H76 8,5±2,5 12,5±5,5 0 0 17 H77 19±0 11,5±1,5 0 0 6.5 8±0 0 20,5±0,5 18 H78 12 9±0 0 0 19 H108 16,5±3,5 15±5 0 0 7±0 6,5±0,5 5,5±0,5 16±1 (+): đường kính vòng kháng <5mm,
Trong đó: ĐC1: dịch nuôi vi khuẩn điều chỉnh về pH 7, không bổ sung catalase, giữ ở nhiệt độ phòng (32 0C) trong 3 giờ. ĐC2: dịch nuôi vi khuẩn điều chỉnh về pH 7, bổ sung catalase, ủ ở 500C trong 3 giờ .
EZ-T và EZ-PK: lần lượt là dịch bacteriocin thô điều chỉnh về pH 7, được xử lý catalase + trypsin hoặc proteinase K, ủ ở 500C trong 3 giờ.
3.4. Ảnh hưởng của enzyme, nhiệt độ và pH đến hoạt tính kháng khuẩn của các chủng tuyển chọn của các chủng tuyển chọn
a) Kết quả thử độ bền với enzyme lipase và α-amylase
Kết quả từ Bảng 3.3 và 3.4 cho thấy hai loại enzyme proteinase K và trypsin hoàn toàn loại bỏ hoạt tính kháng khuẩn của các bacteriocin từ các chủng H9, H18, H51, H61, H77, H108. Ngược lại, bacteriocin của 6 chủng này vẫn giữ hoạt tính sau khi xử lý với hai loại enzyme lipase và α- amylase (Hình 3.8.). Điều này chứng tỏ cấu trúc bacteriocin của các chủng này không có thành phần lipid hoặc hydrocarbon. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của một số enzyme thủy phân lên hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô từ các chủng tuyển chọn đối với vi khuẩn chỉ thị
Entercoccusfaecalis B1.1 Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm) STT Chủng ĐC1 (2 giờ, 32oC) ĐC2 (2 giờ, 20oC lipase (2 giờ, 37oC) α- amylase (2 giờ, 20oC) 1 H9 20 21 17 19 2 H18 30 25 26 32 3 H51 35 32 22 21 4 H61 18 20 18 15 5 H77 28 34 25 25 6 H108 32 30 21 14
Một số công trình nghiên cứu về bacteriocin từ vi khuẩn biển cũng cho kết quả tương tự. Theo nghiên cứu của Prasal và cộng sự [72], bacteriocin từ V. harveyi VIB 571 giảm hoạt tính với các loại enzyme lipase, proteinase K, pepsin, trypsin, pronase E khi ủ trên 60oC trong vòng 10 phút. Theo nghiên cứu của Pirzada và cộng sự [71] khi phân lập và nghiên cứu chủng vi khuẩn sinh bacteriocin ZM81 cho kết quả là chủng này cũng bị giảm hoạt tính khi dịch chiết tế bào được xử lý với enzyme pronase và trypsin. Còn đối với vibriocin AVP10 thì bị bất hoạt hoàn toàn bởi ba loại enzyme protease, proteinase K và trypsin, nhưng không bị ảnh hưởng bởi enzyme lipase [69].
b) Độ bền nhiệt của dịch bacteriocin thô
Sau khi đã xác định được bản chất của chất kháng khuẩn của các chủng nghiên cứu, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ bền của bacteriocin từ các chủng này với các mức
nhiệt độ khác nhau. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của 6 loại bacteriocin được thể hiện ở Bảng 3.5 và minh họa trên Hình 3.9.
Bảng 3.5. Độ bền nhiệt của dịch bacteriocin thô từ các chủng tuyển chọn Đường kính vòng kháng khuẩn, mm (hoạt tính còn lại %) Chủng vi khuẩn Đối chứng (32oC, 30 phút) 60 o C, 30 phút 100oC, 30 phút 121 o C, 15 phút H9 12 (100) 11 (91,7) 0 0 H18 13 (100) 10 (76,9) 0 0 H51 13 (100) 13 (100) 0 0 H61 15 (100) 11 (73,3) 0 0 H77 10 (100) 0 0 0 H108 17 (100) 12 (70,6) 5 (29,4) 0
Kết quả từ Bảng 3.5 cho thấy cả các loại bacteriocin từ 6 chủng vi khuẩn (H9, H18, H51, H61, H77 và H108) đều kém bền nhiệt. Khi xử lý ở 60oC (30 phút) các chủng vẫn còn hoạt tính, mạnh nhất là bacteriocin sinh từ chủng H51 vẫn giữ hoạt tính 100% và bacteriocin của chủng H77 kém bền với nhiệt nhất, do đã mất hoàn toàn hoạt tính ở mức nhiệt độ này. Hầu hết các dịch bacteriocin bị mất hết hoạt tính sau khi xử lý ở 100oC, trong 30 phút, ngoại trừ dịch bacteriocin từ vi khuẩn H108 vẫn giữ 29,4% hoạt tính. Không có chủng nào còn hoạt tính trong điều kiện khử trùng ở 121oC, trong 15 phút (Hình 3.9). Như vậy, hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin từ các chủng tuyển chọn bị ảnh hưởng lớn bởi nhiệt độ. Do đó, để sản xuất bacteriocin hoặc chế phẩm vi sinh bacteriocin cần quan tâm đến nhiệt độ trong quy trình sản xuất từ khâu nuôi cấy, thu nhận đến bảo quản.
Bacteriocin của các chủng vi khuẩn khác nhau thì khác nhau. Trong nghiên cứu này, bacteriocin từ 5 chủng H9, H18, H51, H61 và H77 kém bền nhiệt giống với loại bacteriocin lactocin 27 [34], colicin [73], klebisin [64], hay loại bacteriocin được sinh ra từ Vibrio sp. NM10 [89]. Tuy nhiên, kết quả của bacteriocin từ chủng H108 tương đối giống với bacteriocin vibriocin AVP10 phân lập từ vi khuẩn biển trong công trình nghiên cứu của trường đại học Karachi, Pakistan cho thấy loại này rất bền với nhiệt
độ. Nó vẫn còn hoạt tính ở 60oC (60 phút), 80oC ( 40 phút) và 100oC (20 phút). Đặc biệt vibriocin AVP10 vẫn bền ở nhiệt độ hấp khử trùng (121oC, 15 atm, 15 phút) [69]. Hay các loại bacteriocin từ các chủng lactic PĐ14, BV20, PĐ2.9, hoạt tính của chúng khi bị xử lý ở nhiệt độ từ 60oC – 100oC hầu như không thay đổi trong dung dịch đệm ở pH =2 [9].
Hình 3.8. Ảnh hưởng của lipase và α-amylase hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô từ các chủng tuyển chọn
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính của dịch bacteriocin thô của chủng H108 và H18
c) Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin
Kết quả từ Bảng 3.6 cho thấy các loại bacteriocin từ các chủng nghiên cứu bền với dải pH nằm trong khoảng 4 -10. Ở mức pH=2 có bacteriocin của hai chủng H18 và