16S rDNA và rpoB
Sau khi được tách chiết DNA tổng số, 6 chủng nghiên cứu được tiến hành phản ứng PCR với đoạn mồi đặc hiệu cho đoạn gen 16S rDNA. Kết quả điện di sản phẩm PCR của đoạn gen 16S rDNA của 6 chủng H9, H18, H51, H61, H77 và H108 được
trình bày trên Hình 3.13. Sau đó, sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn này được giải trình tự.
Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rDNA của các chủng vi khuẩn phân lập được trình bày chi tiết tại Phụ lục 3. Trình tự của các chủng nghiên cứu được gửi đi lưu trữ ở Ngân hàng gen quốc tế (Genbank) với mã số gen là KC984665, KC984666, KC984667, KC984668, KC984669 và KC984670, tương ứng lần lượt các chủng H9, H18, H51, H61, H77 và H108. Khi so sánh trình tự của các chủng này, với các trình tự tương đồng trên Ngân hàng gen quốc tế (GenBank) cho kết quả được trình bày trên Bảng 3.8 và 3.9.
Hình 3.13. Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn phân lập trên gel agarose 1%
Từ Bảng 3.8 cho thấy trình tự đoạn gen 16S rDNA của 5 chủng H9, H18, H51, H61 và H108 tương đồng 100% với nhau và với vi khuẩn Cronobacter sakazakii
Lc10g, 99,6% với C. malonaticus PHLTA-12. Kết quả này xác định 5 chủng này thuộc một loài của chi Cronobacter. Kết quả này cũng được xác nhận trên cây phát sinh loài (Hình 3.14), trong đó chỉ ra 5 chủng này có quan hệ gần gũi nhất với C. sakazakii và C. malonaticus.
Bảng 3.8. So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của 5 chủng H9, H18, H51, H61 và H108 với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST
Độ tương đồng (%) Mã số gen Chủng vi khuẩn Tỉ lệ che phủ Mức ý nghĩa H9 H18 H51 H61 H108 JQ963902 Cronobacter sakazakii Lc10g 100% 0 100 100 100 100 100 JQ963900 Cronobacter sakazakii Md6g 100% 0 100 100 100 100 100 FJ906904 Cronobacter sakazakii Jor52 100% 0 99,7 99,7 99,7 99,7 99,7 JQ963901 Cronobacter sakazakii Lc10s 100% 0 99,7 99,7 99,7 99,7 99,7 FN401362 Cronobacter sakazakii partial 100% 0 99,7 99,7 99,7 99,7 99,7 EF088372 Cronobacter sakazakii v328 100% 0 99,7 99,7 99,7 99,7 99,7 FN401344 Cronobacter malonaticus PHLTA-12 100% 0 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 AY752938 Enterobacter sakazakii z954 100% 0 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5
Hình 3.14. Cây phát sinh loài dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA của các chủng H9, H18, H51, H61, H108 và các chủng chuẩn (type strain) của các loài trong chi Cronobacter. Cây được xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood. Mã số Genbank được chỉ ra trong ngoặc đơn. Đơn vị khoảng cách tiến hóa được thể hiện bằng thanh ngang. Chỉ số bootstrap ≥ 50% được chỉ ra trên các nhánh. Proteus mirabilis HI4320 được sử dụng làm nhóm
ngoại.
Kết quả từ Bảng 3.9 cho biết trình tự gen 16S rDNA của chủng H77 tương đồng 99,7 - 100 % với các chủng của loài Enterobacter cloacae, 99,2% với Enterobacter kobei BM0593, 98,1% với Enterobacter cowanii 6L. Kết quả này cũng được xác nhận
khi phân tích phát sinh loài (Hình 3.15). Trong đó chỉ ra, chủng H77 có quan hệ gần gũi nhất với Enterobacter cloacae và tách biệt rõ ràng với E. Kobei và E. cowanii. Do vậy, chủng H77 có thể thuộc loài E. cloacae.
Bảng 3.9. So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng H77 (1064 nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST
Mã số gen Chủng vi khuẩn Tỉ lệ che
phủ (%)
Mức ý nghĩa
Độ tương đồng (%)
JX188069 Enterobacter cloacae AB2 100 0 100 JX495602 Enterobacter cloacae Bio103 100 0 100
HQ154578 Enterobacter cloacae R6-354 100 0 99,9
HQ154552 Enterobacter cloacae R10-1A 100 0 99,9 JN644534 Enterobacter cloacae BR8_1A 100 0 99,7 JN644526 Enterobacter cloacae 56_2_1A 100 0 99,7 JQ680938 Enterobacter kobei BM0593 100 0 99,2 DQ919062 Enterobacter cowanii 6L 100 0 98,1
Hình 3.15. Cây phát sinh loài dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng H77 và các chủng chuẩn (type strain) của các loài trong chi Enterobacter.
Cây được xây dựng bằng phương pháp Neighbor Joining. Mã số Genbank được chỉ ra trong ngoặc đơn. Đơn vị khoảng cách tiến hóa được thể hiện bằng thanh ngang. Chỉ số bootstrap ≥ 50% được chỉ
Nhằm bổ trợ và khẳng định chính xác kết quả định danh các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA, chúng tôi tiến hành định danh hai chủng H108 và H77 bằng giải trình tự đoạn gen rpoB. Kết quả trình tự đoạn gen
rpoB của hai chủng này được thể hiện trong Phụ lục 3. Hai trình tự đoạn gen này được
gửi đi lưu trữ tại ngân hàng gen quốc tế (Genbank) với mã số là KF028398 (H77), KF028399 (H108). Bảng 3.10 và 3.11 thể hiện kết quả khi so sánh trình tự của chủng H77 và H108 với các trình tự các chủng trên ngân hàng gen quốc tế bằng công cụ BLAST.
Bảng 3.10. So sánh trình tự đoạn gen rpoB của chủng H108 (857 nuleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST
Mã số gen Chủng vi khuẩn Tỉ lệ che
phủ (%) Mức ý nghĩa Độ tương đồng (%) JF330143 Cronobacter sakazakii fmb04 100 0 99,5 DQ836224 Cronobacter sakazakii LMG 5740 100 0 99,5 FJ717657 Cronobacter sakazakii ATCC 29544 100 0 99,5 JF330147 Cronobacter sakazakii fmb08 100 0 99,4 FJ717659 Cronobacter malonaticus LMG 23826 100 0 92,1
Bảng 3.11. So sánh trình tự đoạn gen rpoB của chủng H77 (904 nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST
Mã số gen Chủng vi khuẩn Tỉ lệ che (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phủ (%)
Mức ý nghĩa
Độ tương đồng (%)
AJ543726 Enterobacter cloacae ATCC 13047 100 0 99,7 AJ543669 Enterobacter cloacae EN_287 100 0 99,7 AJ543681 Enterobacter cloacae EN_325 100 0 97,5 AJ543712 Enterobacter cloacae EN_508 100 0 97,4 JX494753 Enterobacter kobei CCVG 49023 100 0 95,1 JX425271 Enterobacter cowanii LMG 23569 100 0 90,6
Kết quả từ Bảng 3.10 và 3.11 cho thấy chủng H108 có trình tự đoạn gen rpoB có độ tương đồng cao nhất là 99,5% với Cronobacter sakazakii, 92,1% với
Cronobacter malonaticus; chủng H77 có độ tương đồng cao nhất là 99,7% với Enterbacter cloacae, 95,1% với E. kobei và 90,6% với E. cowanii.
Kết quả định danh dựa trên trình tự đoạn gen rpoB phù hợp với định danh dựa trên đoạn gen 16S rDNA, nhưng trình tự đoạn gen rpoB tạo ra độ khác biệt lớn hơn
giữa các loài gần gũi so với các trình tự đoạn gen 16S rDNA.
Tương tự, Hình 3.16 chỉ ra mối quan hệ phát sinh loài của 2 chủng H108 và H77 với các loài gần gũi nhất. Điều đó cho thấy rằng chủng H108 có quan hệ gần gũi với Cronobacter sakazakii hơn so với C. malonaticus; chủng H77 có quan hệ gần gũi nhất với chủng Enterobacter cloacae.
Hình 3.16. Cây phát sinh loài dựa trên trình tự đoạn gen rpoB của chủng H108, H77 và các chủng có quan hệ gần gũi. Cây được xây dựng bằng phương pháp Neighbor Joining. Mã số Genbank được chỉ ra trong ngoặc đơn. Đơn vị khoảng cách tiến hóa được thể
hiện bằng thanh ngang. Chỉ số bootstrap ≥ 50% được chỉ ra trên các nhánh. Proteus mirabilis ATCC 29906 được sử dụng làm nhóm ngoại.
Như vậy, kết hợp định danh các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA và rpoB, chúng tôi đã xác định được các chủng H9, H18, H51, H61 và H108 thuộc loài Cronobacter sakazakii, và chủng H77 thuộc loài Enterobacter cloacae.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Từ 9 mẫu tu hài thu từ vịnh Nha Trang và vịnh Cam Ranh, Khánh Hòa, tổng số 128 chủng vi khuẩn biển đã được phân lập.
2. Trong số này có 26 chủng thể hiện hoạt tính kháng với ít nhất 1 trong 3 chủng vi khuẩn chỉ thị nghiên cứu có tiềm năng gây bệnh trong thực phẩm, thủy sản (Entercoccus faecalis B1.1, Vibrio alginolyticus V3.3 và V. parahaemolyticus C1).
3. Kết quả xử lý dịch nuôi vi khuẩn sau ly tâm với trypsin và proteinase K cho thấy có 19/26 chủng sinh bacteriocin, trong đó có 6 chủng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và ổn định nhất: H9, H18, H51, H61, H77 và H108.
4. Dịch bacteriocin thô từ 6 chủng này chỉ bền ở nhiệt độ từ 30 - 60oC, bị bất hoạt hoàn toàn ở 100oC trở lên (ngoại trừ chủng H108); bền ở pH 4-10 (riêng chủng H108 bền trong dải pH=2-12); không bị bất hoạt khi xử lý với enzyme lipase và α- amylase. Như vậy, các bacteriocin của các chủng này có thể thuộc lớp III.
5. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào cho thấy, 6 chủng này thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, có hình que ngắn, có đặc điểm khuẩn lạc đa dạng.
6. Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự đoạn gen 16S rDNA và
rpoB cho thấy 5 chủng H9, H18, H51, H61 và H108 thuộc loài Cronobacter sakazakii,
còn chủng H77 thuộc loài Enterobacter cloacae. Đây là nghiên cứu đầu tiên về hoạt
tính bacteriocin ở chi Cronobacter.
Kiến nghị
1. Tiếp tục nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và enzyme đến hoạt tính kháng khuẩn của các chủng còn lại.
2. Xác định mối quan hệ giữa sinh trưởng và sinh bacteriocin của 6 chủng H9, H18, H51, H61, H77, và H108 nhằm xác định thời điểm thu nhận bacteriocin cực đại
3. Nghiên cứu cấu trúc gen mã hóa bacteriocin của 6 chủng này.
4. Nghiên cứu khả năng ứng dụng các chủng vi khuẩn H9, H18, H51, H61, H77 và H108 thành probiotic trong NTTS.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Văn Duy (2011), "Bacteriocin biển: Loại thuốc mới cho nuôi trồng hải sản",
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản,(4), tr. 182 - 187. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty và Nguyễn Thị Kim Quy (2002), "Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của các loài Lactobacillus plantarum L24", Tạp chí di truyền học và ứng dụng, 36, tr. 34.
3. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang tề, Nguyễn Hữu Dũng và Đỗ Thị Muội (2004), Bệnh học thủy sản, NXB Nông Nghiệp.
4. Đỗ Thị Hòa, Trần Vỹ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang và Nguyễn Thị Nguyệt Huệ (2008), "Các loại bệnh thường gặp trên cá biển nuôi Khánh Hòa", Tạp chí khoa học và công nghệ thủy sản-Đại học Nha Trang, (1), tr. 16 - 24.
5. Phạm Thị Hiền Hòa (2011), Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn Bacillus spp. từ đầm nuôi tôm tại Hải Phòng làm nguồn nguyên liệu sản xuất probiotic trong nước, Luận văn Thạc sĩ khoa học, Khoa Nuôi trồng thủy sản, Trường Đại học Nha Trang. 6. Nguyễn Thúy Hương và Trần Thị Tưởng An (2008), "Thu nhận Bacteriocin bằng
phương pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactic cố định trên chất mang Cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu", Tạp chí Phát triển Khoa học & Công nghệ, Đại học Quốc gia Tp.HCM, 11(9), tr. 100-109.
7. Bùi Quang Tề (1996), "Bệnh tôm cá và một số giải pháp phòng trị bệnh", Tạp chí thủy sản, tr. 17-18.
8. Trần Linh Thước (2007), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực phẩm và mĩ phẩm, NXB Giáo dục, Tp Hồ Chí Minh.
9. Nguyễn Hương Trà, Nguyễn Thị Hồng Hà, Nguyễn Tuấn và Nguyễn Thùy Châu (2001), Nghiên cứu công nghệ sản xuất bacteriocin, Kết quả nghiên cứu KH-CN của viện công nghệ sau thu hoạch Viện công nghệ sau thu hoạch.
10. Hoa Thị Minh Tú, Nguyễn Thị Đà và Lê Thanh Bình (2009), "Đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn Lactic sinh tổng hợp Bacteriocin", Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 47(5), tr. 17-25.
11. Lê Thị Hồng Tuyết và Hoàng Quốc Khánh (2004), Một số đặc tính của bacteriocin sản xuất bởi vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, Báo cáo khoa học, Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Quốc gia Việt Nam.
Tài liệu tiếng Anh
12. Abee, T., Krockel, L. and Hill, C. (1995), "Bacteriocin: modes of action and potentials in food preservation and control of food poisoning", Food Microbiology, 28, pp. 169- 185.
13. Alderman, D.J. and Hastings, T.S (1998), "Antibiotic use in aquaculture: development of antibiotic resistance-potential for consumer health risks", International Journal of Food Science and Technology, 1(33), pp. 139-155.
14. Balacázar, J.L., de Blas, I., Ruiz-Zarzuela, I., Cunningham, D., Vendrell, D. and Muzquiz, J.L. (2006), "Review the role of probiotics in aquaculture", Veterinary Microbiology, 114, pp. 173-186.
15. Balacázar, J.L., Loureiro, L., Silva, Y.J.D., Pintado, J. and Planas, M. (2010), "Identification and characterization of bacteria with antibacterial activities isolated from seahorses (Hippocampus guttulatus)", The Journal of Antibiotics, 63, pp. 271- 274. 16. Bondad- Reantaso, M.G., Subasinghe, R.P., Arthur, J.R., Ogawa, K., Chinabut, S.,
Adlard, R., Tan, Z. and Shariff, M. (2005), "Disease and health management in Asian aquaculture", Vetetinary Parasitology, 132(3-4), pp. 249-272.
17. Braddley, D.E. (1967), "Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins",
Bacteriological Reviews, 31(4), pp. 230-314.
18. Carina Audisio, M., Oliver, G. and Apella, M.C. (2000), "Protective effect of Enterococcus faecium J96, a potential probiotic strain, on chicks infected with Salmonella Pullorum", Joural of Food Protection, 63(10), pp. 1333-7.
19. Carr, F.J., Chill, D. and Maida, N. (2002), "Review The lactic acid bacteria: a literature survey", Critical Review in Microbiology, 28(4), pp. 281-370.
20. Carraturo, A., Raieta, K., Ottaviani, D. and Russo, G.L. (2006), "Inhibition of Vibrio parahaemolyticus by a bacteriocin -like inhibitory substance (BLIS) produced by Vibrio mediterranei", Journal of Applied Microbiology, 101, pp. 234-241.
21. Cascales, E., Buchanan, S.K., Duche, D., Kleanthous, C., Llouble, K., Postle, K., Riley, M., Slatin, S. and Cavard, D. (2007), "Colicin biology", Microbilogy and Mocelular Biology Review, 71(1), pp. 158-229.
22. Chen, H. and Hoover, D.G. (2003), "Bacteriocins and their food applications",
Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2, pp. 82-100.
23. Choi, H.J., Lee, H.S., Her, S., Oh, D.H. and Yoon, S.S. (1999), "Partial characterization and cloning of leuconocin J, a bacteriocin produced by Leuconostoc sp. J2 isolated from the Korean fermented vegetable Kimch", Journal of Applied Microbiology, 86(2), pp. 175-81.
24. Cintas Luis, M., Borrero, J. and Juan, J. (2011), "Protein expression vector and secretion signal peptide optimization to drive the production, secretion, and functional expression of the bacteriocin enterocin A in lactic acid bacteria", Journal of Biotechnology, 156(1), pp. 76-86
25. Claesson, M.J., Li, Y., Leahy, S., Canchaya, C., van Pijkeren, J.P., Cerdeno-Tarraga, A.M., Parkhill, J., Flynn, S., O'Sullivan, G.C., Collins, J.K., Higgins, D., Shanahan, F., Fitzgerald, G.F., van Sinderen, D. and O'Toole, P.W. (2006), "Multireplicon genome architecture of Lactobacillus salivarius", Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 103, pp. 6718-6723.
26. Clark, T.G. and Cassidy-Hanley, D. (2005), "Recombinant subunit vaccines: Potential and constraints", In: P.J, Midtlying, Editor, Progress in Fish vaccinology, Karger, Basel, pp. 153-164.
27. Cleveland, J. and Thomas, J. (2001), "Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation", International Journal of Food Microbiology, 71, pp. 1-20.
28. Coconnier, M.H., Lievin, V., Hemery, E. and Servin, A.L. (1998), "Antagonistic activity against Helicobacter infection in vitro and in vivo by the human Lactobacillus acidophilus strain LB", Applied and Environmental Microbiology, 64(11), pp. 4573-80. 29. Cursino, L., Smajs, D., Smarda, J., Nardi, R.M., Nicoli, J.R., Chartone-Souza, E. and (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nascimento, A.M. (2006), "Exoproducts of the Escherichia coli strain H22 inhibiting some enteric pathogens both in vitro and in vivo", Jounral of Applied Microbiology, 100(4), pp. 821-9.
30. De a Rosa-Garcia, S.C., Munoz-Garcia, A.A., Barahona-Perez, L.F. and Gamboa- Angulo, M.M. (2007), "Antimicrobial properties of moderately halotolerant bacteria from cenotes of the Yucata peninsula", Letters in Applied Microbiology, 45, pp. 289- 294.
31. Deegan, L.H., Cotter, P.D., Hill, C. and Ross, P.R. (2006), "Bacteriocins: Biological tools for bio-preservation and shelf-life extension", International Dairy Journal, 16, pp. 1058-1071.
32. Desriac, F.D., Defer, N., Bourgougnon, B., Brillet, P., Chevalier, Le and Fleury, Y. (2010), "Bacteriocin as Weapons in the Marine Animal-Associated Bacteria Warfare: Inventory and Potential Application as an Aquaculture Probiotic", Marine Drugs, 8, pp. 1153-1177.
33. Diez-Gonzalez, F. (2007), "Use of bacteriocin in livestock", In: Riley MA, Gillor O, Editor, Research and applications in bacteriocins, Horizon Bioscience, Norfolk, pp. 117-129.
34. Dobson, A.E., Sanozky-Dawes, R.B. and Klaenhammer, T.R. (2007), "Identification of an operon and inducing peptide involved in the production of lactacin B by
Lactobacillus acidophilus", Journal of Applied Microbiology, 103(5), pp. 1766-78. 35. Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y. and McMullen, L.M.H. (2006), "Review The
continuing story of class IIa bacteriocins", Microbiology and Molecular Biology Reviews,. 70(2), pp. 564-82.
36. Duquesne, S., Destoumieux-Garzon, D., Peduzzi, J. and Rebuffat, S. (2007), "Microcins, gene-encoded antibacterial peptides from enterobateia", Natural Product Reports, pp. 708-734.
37. Dutton, C.J., Haxell, M.A., McArthur, H.A.I and Wax, Eds R.G. (2002), "Peptide antibiotics: discovery, modes of action, and applications", Jounral of Antimicrobial Chemotherapy, 50, p. 149.
38. Ellen, A.F., Rohulya, O.V., Fusetti, F., Wagner, M., Albers, S.V. and Driessen, A.J.