của các chủng tuyển chọn
a) Kết quả thử độ bền với enzyme lipase và α-amylase
Kết quả từ Bảng 3.3 và 3.4 cho thấy hai loại enzyme proteinase K và trypsin hoàn toàn loại bỏ hoạt tính kháng khuẩn của các bacteriocin từ các chủng H9, H18, H51, H61, H77, H108. Ngược lại, bacteriocin của 6 chủng này vẫn giữ hoạt tính sau khi xử lý với hai loại enzyme lipase và α- amylase (Hình 3.8.). Điều này chứng tỏ cấu trúc bacteriocin của các chủng này không có thành phần lipid hoặc hydrocarbon.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của một số enzyme thủy phân lên hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô từ các chủng tuyển chọn đối với vi khuẩn chỉ thị
Entercoccusfaecalis B1.1 Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm) STT Chủng ĐC1 (2 giờ, 32oC) ĐC2 (2 giờ, 20oC lipase (2 giờ, 37oC) α- amylase (2 giờ, 20oC) 1 H9 20 21 17 19 2 H18 30 25 26 32 3 H51 35 32 22 21 4 H61 18 20 18 15 5 H77 28 34 25 25 6 H108 32 30 21 14
Một số công trình nghiên cứu về bacteriocin từ vi khuẩn biển cũng cho kết quả tương tự. Theo nghiên cứu của Prasal và cộng sự [72], bacteriocin từ V. harveyi VIB 571 giảm hoạt tính với các loại enzyme lipase, proteinase K, pepsin, trypsin, pronase E khi ủ trên 60oC trong vòng 10 phút. Theo nghiên cứu của Pirzada và cộng sự [71] khi phân lập và nghiên cứu chủng vi khuẩn sinh bacteriocin ZM81 cho kết quả là chủng này cũng bị giảm hoạt tính khi dịch chiết tế bào được xử lý với enzyme pronase và trypsin. Còn đối với vibriocin AVP10 thì bị bất hoạt hoàn toàn bởi ba loại enzyme protease, proteinase K và trypsin, nhưng không bị ảnh hưởng bởi enzyme lipase [69].
b) Độ bền nhiệt của dịch bacteriocin thô
Sau khi đã xác định được bản chất của chất kháng khuẩn của các chủng nghiên cứu, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ bền của bacteriocin từ các chủng này với các mức
nhiệt độ khác nhau. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của 6 loại bacteriocin được thể hiện ở Bảng 3.5 và minh họa trên Hình 3.9.
Bảng 3.5. Độ bền nhiệt của dịch bacteriocin thô từ các chủng tuyển chọn Đường kính vòng kháng khuẩn, mm (hoạt tính còn lại %) Chủng vi khuẩn Đối chứng (32oC, 30 phút) 60 o C, 30 phút 100oC, 30 phút 121 o C, 15 phút H9 12 (100) 11 (91,7) 0 0 H18 13 (100) 10 (76,9) 0 0 H51 13 (100) 13 (100) 0 0 H61 15 (100) 11 (73,3) 0 0 H77 10 (100) 0 0 0 H108 17 (100) 12 (70,6) 5 (29,4) 0
Kết quả từ Bảng 3.5 cho thấy cả các loại bacteriocin từ 6 chủng vi khuẩn (H9, H18, H51, H61, H77 và H108) đều kém bền nhiệt. Khi xử lý ở 60oC (30 phút) các chủng vẫn còn hoạt tính, mạnh nhất là bacteriocin sinh từ chủng H51 vẫn giữ hoạt tính 100% và bacteriocin của chủng H77 kém bền với nhiệt nhất, do đã mất hoàn toàn hoạt tính ở mức nhiệt độ này. Hầu hết các dịch bacteriocin bị mất hết hoạt tính sau khi xử lý ở 100oC, trong 30 phút, ngoại trừ dịch bacteriocin từ vi khuẩn H108 vẫn giữ 29,4% hoạt tính. Không có chủng nào còn hoạt tính trong điều kiện khử trùng ở 121oC, trong 15 phút (Hình 3.9). Như vậy, hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin từ các chủng tuyển chọn bị ảnh hưởng lớn bởi nhiệt độ. Do đó, để sản xuất bacteriocin hoặc chế phẩm vi sinh bacteriocin cần quan tâm đến nhiệt độ trong quy trình sản xuất từ khâu nuôi cấy, thu nhận đến bảo quản.
Bacteriocin của các chủng vi khuẩn khác nhau thì khác nhau. Trong nghiên cứu này, bacteriocin từ 5 chủng H9, H18, H51, H61 và H77 kém bền nhiệt giống với loại bacteriocin lactocin 27 [34], colicin [73], klebisin [64], hay loại bacteriocin được sinh ra từ Vibrio sp. NM10 [89]. Tuy nhiên, kết quả của bacteriocin từ chủng H108 tương đối giống với bacteriocin vibriocin AVP10 phân lập từ vi khuẩn biển trong công trình nghiên cứu của trường đại học Karachi, Pakistan cho thấy loại này rất bền với nhiệt
độ. Nó vẫn còn hoạt tính ở 60oC (60 phút), 80oC ( 40 phút) và 100oC (20 phút). Đặc biệt vibriocin AVP10 vẫn bền ở nhiệt độ hấp khử trùng (121oC, 15 atm, 15 phút) [69]. Hay các loại bacteriocin từ các chủng lactic PĐ14, BV20, PĐ2.9, hoạt tính của chúng khi bị xử lý ở nhiệt độ từ 60oC – 100oC hầu như không thay đổi trong dung dịch đệm ở pH =2 [9].
Hình 3.8. Ảnh hưởng của lipase và α-amylase hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô từ các chủng tuyển chọn
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính của dịch bacteriocin thô của chủng H108 và H18
c) Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin
Kết quả từ Bảng 3.6 cho thấy các loại bacteriocin từ các chủng nghiên cứu bền với dải pH nằm trong khoảng 4 -10. Ở mức pH=2 có bacteriocin của hai chủng H18 và H51 bị mất hoạt tính hoàn toàn. Kết quả tương tự ở mức pH=12 đối với ba loại bacteriocin từ H9, H61 và H77. Tuy nhiên, bacteriocin của H18, H51 và H108 lại có hoạt tính lần lượt là 125%, 110% và 114,3% cao hơn mẫu đối chứng (pH=7, 100%)
khi điều chỉnh về pH 6, chứng tỏ chúng bền nhất trong điều kiện acid nhẹ. Ngược lại, ở mức pH=8 có bacteriocin từ H9 có hoạt tính 110%, .chứng tỏ loại bacteriocin này bền nhất trong điều kiện kiềm nhẹ
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô từ các chủng tuyển chọn
Đường kính vòng kháng khuẩn, mm (hoạt tính còn lại,%) STT Chủng pH=2 (30 phút) pH=4 (30 phút) pH=6 (30 phút) pH=7 (30 phút) pH=8 (30 phút) pH=10 (30 phút) pH=12 (30 phút) 1 H9 7(70) 8(80) 9(90) 10(100) 11(110) 7(70) 0 2 H18 0 7(87,5) 10(125) 8(100) 8(100) 6(75) 4(50) 3 H51 0 8(80) 11(110) 10(100) 9(90) 4(40) 4(40) 4 H61 4(36,4) 6(54,5) 8(72,7) 11(100) 8(72,7) 7(63,6) 0 5 H77 6(46,1) 10(76,9) 12(92,3) 13(100) 11(84,6) 9(69,2) 0 6 H108 4(28,6) 7(50) 16(114,3) 14(100) 13(92,9) 10(71,4) 6(42,9)
Khi so sánh với các kết quả của các công trình nghiên cứu trước đây, bacteriocin của chủng H108 có kết quả tương tự đối với hai loại Perfreingocin 11105, Butyricin 7423 [96], là vẫn giữ được hoạt tính trong ngưỡng pH=2-12. Trong khi đó, các loại bacteriocin được sản sinh từ vi khuẩn H9, H61 lại có kết quả tương tự với Boticin E -S5 (pH 1,1 -9,5) [96].
Dải pH bền của các loại bacteriocin sinh từ các chủng nghiên cứu khá rộng (có thể bền trong khoảng pH=4-10) so với các bacteriocin được nghiên cứu gần đây, điều này có ý nghĩa thực tiễn lớn bởi phần lớn các bacteriocin đều có khoảng pH bền tương đối hẹp. Với một số nghiên cứu bacteriocin của các chủng thuộc vi khuẩn lactic thì chúng có khả năng hoạt động trong khoảng pH=2-7. Ở giá trị pH=8 và pH=9 thì chúng bị mất hoạt tính kháng khuẩn [10]. Với kết quả khảo sát trên, có thể đây là các loại bacteriocin mới có khả năng ứng dụng cao nhờ vào khả năng hoạt động trong dải pH khá rộng này.
Nói tóm lại, dịch bacteriocin từ các chủng nghiên cứu thuộc nhóm kém bền nhiệt (chỉ bền nhiệt trong khoảng 30-60oC, mất hoạt tính hoàn toàn ở 100oC trở lên, ngoại trừ bacteriocin từ chủng H108). Tuy nhiên, chúng lại bền trong khoảng pH 4-10 (riêng bacteriocin của chủng H018 bền trong dải pH=2-12), và không bị bất hoạt khi
xử lý với enzyme lipase và α – amylase. Do đó, có thể kết luận rằng:bacteriocin của các chủng nghiên cứu có thể thuộc về lớp III, là nhóm bacteriocin kém bền nhiệt, không có nhóm ngoại lipid và hydrocarbon trong cấu trúc.
Hình 3.10. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của dịch bacteriocin thô từ chủng H108