2.3.4.1. Thử độ bền với enzyme của dịch bacteriocin thô
Phương pháp thực hiện tương tự như mục 2.3.3.2 đã trình bày ở trên. Tuy nhiên, thời gian và điệu kiện ủ enzyme được thực hiện như sau:
- Mẫu xử lý với α-amylase ở nồng độ cuối cùng là 1 mg/ml, sau đó ủ ở 20oC trong 2 giờ;
- Mẫu xử lý với lipase ở nồng độ cuối cùng là 1000U, ủ ở 37oC trong 2 giờ. Sau khi xử lý enzyme, các dịch bacteriocin được nhỏ vào các giếng trên đĩa thạch. Kết quả được kiểm tra dựa trên kích thước vòng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị Enterococcus faecalis B1.1 bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Đối chứng 1 là dịch bacteriocin thô không xử lý enzyme, ở nhiệt phòng (32oC), và đối chứng 2 là dịch bacteriocin xử lý với catalase. Sau 12÷16 giờ kiểm tra sự tạo thành vòng kháng và đo đường kính các vòng kháng khuẩn.
2.3.4.2. Xác định độ bền với nhiệt của dịch bacteriocin thô
Nuôi cấy vi khuẩn và tiến hành thu dịch bacteriocin thô (các thao tác thu dịch nuôi đã mô tả trước đó), chuẩn độ pH về giá trị 7. Hút lần lượt ra các ống nghiệm đã
sấy tiệt trùng, mỗi ống nghiệm 5 ml đem đi xử lý ở các nhiệt độ sau: 60oC, 100oC bằng cách ủ ở bể ổn nhiệt trong 30 phút và 121oC ở nồi hấp trong vòng 15 phút. Sau khi xử lý, mẫu được ủ ở 4oC (trong 10 phút).
Mẫu đối chứng dương là dịch bacteriocin thô không xử lý nhiệt, để ở nhiệt độ phòng (32oC, 30 phút). Sau khi xử lý nhiệt, dịch nuôi được đem kiểm tra hoạt tính vòng kháng khuẩn như đã trình bày ở trên.
2.3.4.3. Xác định độ bền với pH của dịch bacteriocin thô
Các thao tác nuôi cấy và chuẩn bị dịch bacteriocin tương tự như trên, hút lần lượt ra các ống nghiệm đã sấy tiệt trùng có ghi sẵn các giá trị pH cần chuẩn, mỗi ống 10 ml dịch.
Chuẩn độ pH ở các thang 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12 bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N, đem ủ trong tủ ấm 37oC trong vòng 30 phút. Cuối cùng chuẩn độ pH về giá trị 7.
Sau đó, dịch nuôi được đem kiểm tra hoạt tính vòng kháng khuẩn như đã trình bày ở trên.
2.3.5. Xác định hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn 2.3.5.1. Xác định hình thái khuẩn lạc 2.3.5.1. Xác định hình thái khuẩn lạc
Quan sát và mô tả hình dạng kích thước và màu sắc khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn, sử dụng phương pháp cấy ria và cấy điểm chủng vi sinh vật trên môi trường đĩa thạch tương ứng.
Hoạt hóa chủng vi khuẩn gốc được giữ trong glycerol bằng cách hút 1 ml dịch vi khuẩnnuôi cấy trong môi trường TSB, ở điều kiện 37oC trong 16÷24 giờ. Dùng que cấy ria, lấy một vòng dịch vi khuẩn đã hoạt hóa cấy ria và cấy điểm trên môi trường thạch đĩa TSA, nuôi cấy ở điều kiện như trên. Quan sát và mô tả hình thái, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc sau 18÷24 giờ.
2.3.5.2. Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn
Hình thái tế bào được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram như sau: Tế bào vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường TSB có bổ sung 1,5% NaCl trong vòng 24 giờ, sau đó được đem làm tiêu bản nhuộm Gram. Sau khi cố định vết bôi, nhuộm bằng dung dịch Crytal violet trong trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhuộm lại bằng dung dịch Glucol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhỏ dịch tẩy màu (cồn 90o), giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô. Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 1 phút, rửa nước, để khô trong không khí. Soi dưới kính hiển
vi quang học (vật kính dầu 100x), vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng đỏ.
2.3.6. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rDNA và rpoB rDNA và rpoB
Tách chiết DNA hệ gen
Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường TSB ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 2 phút ở 4oC để thu tế bào [61]. DNA tổng số được tách chiết bằng bộ kit Wizard® SV Genomic DNA System (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sau đó bảo quản ở -20oC.
Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA bằng kỹ thuật PCR
Đoạn gen 16S rDNA của vi khuẩn được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi tương ứng được tổng hợp bởi IDT (Mỹ) có trình tự như sau:
16S-27F 5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3' 16S-1492R 5'ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT 3' [61].
Phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 50 µl với các thành phần ở nồng độ cuối cùng như sau: DNA (2-20 ng), mỗi mồi (0,1 µM), dNTP (0,1 mM mỗi loại), MgCl2 (2 mM), Taq polymerase (1,25 U) và đệm Tag (1X). Chu kì nhiệt của phản ứng bao gồm biến tính ban đầu ở 94oC trong 5 phút; 35 chu kì của 94oC trong 1 phút, 62oC trong 1 phút và 72oC trong 1 phút 30’; và cuối cùng kết thúc ở 72oC trong 7 phút. Qui trình và nồng độ hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR được trình bày cụ thể trong phụ lục 1. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1-1,5% trong đệm TBE 0,5X, sau đó được nhuộm với ethidium bromide và đọc kết quả trên máy chụp ảnh gel (Biorad).
Khuếch đại đoạn gen rpoB bằng kỹ thuật PCR
Đoạn gen rpoB của vi khuẩn được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi tương ứng được tổng hợp bởi IDT (Mỹ) có trình tự như sau:
CM7 (5’-AACCAGTTCCGCGTTGGCCTGG-3’) CM31b (5’-CCTGAACAACACGCTCGGA-3’), [65]
Phản ứng PCR được tiến hành tương tự như trên với ngoại trừ là nhiệt độ trong chu trình nhiệt được thiết kế như sau: nhiệt độ biến tính ban đầu ở 94oC trong 3 phút; 35 chu kì của 94oC trong 30 giây, 52oC trong 30 giây và 72oC trong 1 phút 20’; và cuối cùng kết thúc ở 72oC trong 7 phút. Qui trình và nồng độ hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR được trình bày cụ thể trong phụ lục 2.
Giải và phân tích trình tự
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PCR clean up system (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sử dụng làm khuôn trực tiếp cho phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye Terminator v. 3.1, Applied Biosystems) với các cặp mồi 16S-27F/16S-1492R theo chương trình nhiệt như sau: 96°C trong 20 giây, 50°C trong 20 giây và 60°C trong 4 phút. Sản phẩm phản ứng được phân tích trên máy phân tích trình tự tự động ABI Prism 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.7. Phân tích quan hệ phát sinh loài
Các trình tự DNA của các chủng vi khuẩn và các trình tự tham chiếu có sẵn trên GenBank sẽ được sử dụng cho việc phân tích trình tự trên NCBI (National Center for Biotechnology Information) sử dụng công cụ nucleotide - BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Tất cả các trình tự DNA sẽ được gióng hàng bằng cách sử dụng ClustalW [57] và các khoảng trống (gap) được loại bỏ bằng phần mềm BioEdit [48]. Mô hình khoảng cách di truyền phù hợp nhất sẽ được lựa chọn với điểm BIC (Bayesian Information Criterion) thấp nhất. Phương pháp Neighbor Joining [92] [81] và Maximum Likelihood sẽ được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA5 [93]. Phương pháp lặp mẫu được sử dụng là Bootstrap với số lần lặp mẫu là 1000 [41].
2.3.8. Xử lý thống kê
Hình 2.1. Sơ đồ các nội dung nghiên cứu chính của luận văn
Kết luận Nghiên cứu tính chất
hóa lý của bacteriocin (độ bền nhiệt, pH, enzyme)
Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh bacteriocin
Xác định hoạt tính kháng khuẩn Xác định bản chất của chất kháng khuẩn
Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học phân tử, định danh, mối quan hệ phát sinh loài
Bảo quản
Phân lập vi khuẩn tổng số Mẫu tu hài
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn từ thịt tu hài
Tổng số vi khuẩn qua 3 lần phân lập được thể hiện ở Bảng 3.1. Từ Bảng 3.1 cho thấy trung bình mật độ vi khuẩn của ba lần phân lập là 7,9 x 104 CFU/g. Dựa vào hình thái, màu sắc khuẩn lạc khác nhau chúng tôi đã phân lập được 128 chủng vi khuẩn. Sau khi thuần khiết, các chủng được bảo quản trong ống eppendorf có bổ sung 30 % glycerol so với dịch vi khuẩn. Kết quả được minh họa trên hình 3.1.
Bảng 3.1. Số chủng vi khuẩn ở các lần phân lập
STT Ngày phân lập Vi khuẩntổng số (CFU/g) Số chủng phân lập (Kí hiệu chủng) 1 27/2/2012 1 x 105 20 (X1.1 - X1.20) 2 24/7/2012 1,23 x 105 50 (H1 –H50) 3 9/10/2012 1,4 x 104 58 (H51 – H58)
Hình 3.1. Khuẩn lạc trên đĩa thạch ở độ pha loãng 10-6 sau 24 giờ nuôi cấy
Như vậy, từ 9 mẫu tu hài (Lutraria philippinarum) thu từ vịnh Nha Trang và Cam Ranh, chúng tôi đã phân lập được 128 chủng vi khuẩn biển.
3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn
Việc xác định hoạt tính đối kháng của vi khuẩn với một chủng vi khuẩn có hại nào đó là rất cần thiết trong tuyển chọn chủng sinh bacteriocin. Tính đối kháng thể hiện qua việc dịch nuôi của vi khuẩn khuếch tán vào môi trường và gây ức chế chủng chỉ thị dẫn đến xuất hiện vòng kháng khuẩn trên đĩa thạch.
Mục tiêu của đề tài là tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh bacteriocin nhằm định hướng sản xuất thuốc phòng trừ dịch bệnh trong NTTS, do đó chúng tôi tập trung khảo sát tính kháng khuẩn của vi khuẩn biển lên một số chủng chỉ thị có hại cho thực phẩm và thủy sản (Entercoccus faecalis. B1.1, Vibrio alginolyticus V3.3, Vibrio
parahaemolyticus C1). Ba chủng vi khuẩn đích này được sử dụng để kiểm tra tính đối kháng của 128 chủng vi khuẩn phân lập được. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng phân lập đối với ba chủng vi khuẩn đích Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm) STT Ký hiệu chủng V. alginoticus V3.3 V. parahaemolyticus C1 Entercoccus faecalis. B1.1 1 X1.4 9,5 ± 0,5 - - 2 X1.5 10,5 ± 0,5 - - 3 X1.9 7,5 ± 0,5 - - 4 X1.10 - 10,5 ± 0.5 - 5 X1.11 7,5 ± 0,5 - - 6 H1 - - 7,5 ± 0,5 7 H2 7 ± 1 - - 8 H5 5 ± 0,5 - - 9 H7 - - 12 ± 1 10 H8 8,5 ± 0,5 - 16 ± 1 11 H9 9 ± 1 - 15,5 ± 0,5 12 H15 6,5 ± 0,5 - - 13 H18 10 - 16 ± 1 14 H21 6,5 ± 0,5 - - 15 H50 9 ± 2 6,5 ± 0,5 - 16 H51 8 ± 1 - 10,5 ± 0,5 17 H53 11 ± 1 - 18 H58 - - 13,5 ± 0,5 19 H61 11,5 ± 0,5 - 11,5 ± 0,5 20 H64 - - 8 21 H73 6 ± 1 - - 22 H74 - - 6 ± 1 23 H76 - - 15 ± 1 24 H77 9,5 ± 0,5 - 17,5 ± 0,5 25 H78 - - 19 26 H108 9 ± 1 - 16 ± 1
Kết quả từ Bảng 3.2 cho thấy trong tổng số 128 chủng phân lập được có 26 chủng vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn với ít nhất một chủng vi khuẩn đích, chiếm 20,3 %. Cụ thể là 14 chủng kháng được Entercoccus faecalis B1.1, 19 chủng kháng
được Vibrio alginolyticus V3.3, và 2 chủng kháng Vibrio parahaemolyticus C1. Trong đó, có 8 chủng (H7, H8, H9, H18, H51, H58, H77, H108) cùng kháng hai chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus V3.3 và Entercoccus faecalis B1.1; nhưng chỉ có một chủng H50 kháng được V. alginolyticus V3.3 và V. parahaemolyticus C1.
Nếu chia theo lần phân lập thì có 5 chủng thuộc lần phân lập thứ nhất, 10 chủng ở lần phân lập thứ hai và 11 chủng trong lần phân lập thứ ba chiếm lần lượt là 19,23%, 38,46 %, và 42,3 % (Hình 3.2). Điều này cho thấy rằng, ở cả vịnh Nha Trang và vịnh Cam Ranh đều có thể phân lập được các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn.
Hình 3.2. Tỉ lệ các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng với vi khuẩn chỉ thị ở ba lần phân lập
Từ Bảng 3.2 và các Hình 3.3, 3.4, 3.5 cho thấy, một số chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, có đường kính từ 15 mm trở lên, như là H1, H9, H77, H78, H108. Ngược lại, có một số chủng có đường kính vòng khuẩn chỉ là 5 - 6 mm (H5, H73, H74).
Nói tóm lại, trong tổng số 128 chủng phân lập được, chúng tôi đã tìm ra 26 chủng có hoạt tính kháng khuẩn với ít nhất một trong ba chủng chỉ thị có tiềm năng gây bệnh trong thực phẩm, thủy sản (Enterococcus faecalis B1.1, Vibrio alginolyticus V3.3 và V. parahaemolyticus C1).
Hình 3.3. Vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn phân lập đối với chủng chỉ thị Vibrio alginolyticus V3.3 trên môi trường TCBS (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.4. Vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn phân lập đối với chủng chỉ thị Entercoccusfaecalis B1.1 trên môi trường TSA
Hình 3.5. Vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn phân lập đối với chủng chỉ thị V. parahaemolyticus C1 trên môi trường TCBS 3.3. Xác định bản chất bacteriocin của các chất kháng khuẩn
Quá trình thử tính kháng của 26 chủng vi khuẩn được lặp lại tối thiểu ba lần, trong đó chúng tôi chọn ra 19 chủng có hoạt tính kháng mạnh, ổn định, và đại diện cho từng vi khuẩn chỉ thị được chọn để kiểm tra bản chất của chất kháng khuẩn bằng cách xử lý dịch nuôi vi khuẩn với trypsin và proteinase K. Cụ thể, có 8 chủng (H7, H8, H9, H18, H51, H61, H77 và H108) cùng kháng với Entercoccus faecalis B1.1 và Vibrio
alginolyticus V3.3; chủng H50 cùng kháng V. alginolyticus V3.3 và V. parahaemolyticus C1; 6 chủng (H1, H58, H64, H74, H78) kháng Entercoccus faecalis
B1.1; 3 chủng (X1.4, X1.5) kháng V. alginolyticus V3.3 và chủng X1.10 kháng V. parahaemolyticus C1.
Kết quả vòng kháng khuẩn sau khi xử lý với enzyme trypsin và proteinase K của dịch bacteriocin thô của 19 chủng trên được trình bày tại Bảng 3.3.
Kết quả từ Bảng 3.3 và minh họa trong Hình 3.6, 3.7 về ảnh hưởng của các loại enzyme đến hoạt tính kháng cho thấy, sau khi xử lý với enzyme proteinase K và trypsin, dịch chiết ngoại bào của các chủng vi khuẩn có tính kháng với Entercoccus faecalis B1.1 đã bị mất hoàn toàn tính kháng khuẩn đến các loại vi khuẩn đích. Trong
khi đó mẫu đối chứng vẫn xuất hiện vòng kháng khuẩn (Hình 3.6). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Balcázar và cộng sự [15] khi tiến hành xử lý dịch ngoại bào của 13 chủng phân lập từ cá ngựa (Hippocampus guttulatus) với hai loại enzyme
trypsin và proteinase K. Trong đó, dịch ngoài bào của 3 chủng (HG – 3F, HG – 12F, HG – 14F) bị mất hoạt tính khi xử lý bằng proteinase K, trong khi đó 2 chủng (HG – 12F, HG – 14F) bị mất hoạt tính khi xử lý bằng trypsin.
Hình 3.6. Vòng kháng khuẩn của dịch bacteriocin của chủng H18 và H76 sau khi xử lý với proteinase K và trypsin, vi khuẩn chỉ thị là Entercoccus
faecalis B1.1
Theo định nghĩa bacteriocin là những hợp chất có bản chất là protein do vi khuẩn sinh tổng hợp và thường có khả năng ức chế các loài vi khuẩn có họ hàng gần với chủng sản sinh ra nó [91]. Bản thân vi khuẩn sản sinh bacteriocin có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Bacteriocin còn bị thủy phân bởi các enzyme như trypsin, pepsin, … Điều đó chứng tỏ các chất kháng khuẩn của các chủng tuyển chọn được là bacteriocin, có bản chất là protein.
Trong nghiên cứu này, có 19/ 128 chủng vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin hoặc chất tương tự bacteriocin, chiếm 14,8%. So với những nghiên cứu trước đây về vi khuẩn sinh bacteriocin thì kết quả này rất khả quan. Theo nghiên cứu của McCall và cộng sự [62] về bacteriocin từ các vi khuẩn biển cho thấy chỉ có 5% trong số 795 chủng có khả năng sinh bacteriocin. Hay Wilson và cộng sự [103] chỉ phân lập được 10% vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin từ cảng Sydney, Australia.
Tuy nhiên, hầu hết dịch chiết ngoại bào có khả năng kháng chủng V. alginolyticus V3.3 và V. parahaemolyticus C1 (chủng X1.10) chỉ bị mất hoạt tính khi
khuẩn trong và rộng hơn so với các mẫu đối chứng (Hình 3.7). Điều này có thể giải thích là do các chủng chỉ thị này mẫn cảm với enzyme proteinase K.
(A) (B)
Hình 3.7. Vòng kháng khuẩn của dịch bacteriocin của hai chủng H18, X1.10 sau khi xử lý với trypsin và proteinase K, vi khuẩn chỉ thị là V.