rDNA và rpoB
Tách chiết DNA hệ gen
Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường TSB ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 2 phút ở 4oC để thu tế bào [61]. DNA tổng số được tách chiết bằng bộ kit Wizard® SV Genomic DNA System (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sau đó bảo quản ở -20oC.
Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA bằng kỹ thuật PCR
Đoạn gen 16S rDNA của vi khuẩn được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi tương ứng được tổng hợp bởi IDT (Mỹ) có trình tự như sau:
16S-27F 5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3' 16S-1492R 5'ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT 3' [61].
Phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 50 µl với các thành phần ở nồng độ cuối cùng như sau: DNA (2-20 ng), mỗi mồi (0,1 µM), dNTP (0,1 mM mỗi loại), MgCl2 (2 mM), Taq polymerase (1,25 U) và đệm Tag (1X). Chu kì nhiệt của phản ứng bao gồm biến tính ban đầu ở 94oC trong 5 phút; 35 chu kì của 94oC trong 1 phút, 62oC trong 1 phút và 72oC trong 1 phút 30’; và cuối cùng kết thúc ở 72oC trong 7 phút. Qui trình và nồng độ hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR được trình bày cụ thể trong phụ lục 1. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1-1,5% trong đệm TBE 0,5X, sau đó được nhuộm với ethidium bromide và đọc kết quả trên máy chụp ảnh gel (Biorad).
Khuếch đại đoạn gen rpoB bằng kỹ thuật PCR
Đoạn gen rpoB của vi khuẩn được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi tương ứng được tổng hợp bởi IDT (Mỹ) có trình tự như sau:
CM7 (5’-AACCAGTTCCGCGTTGGCCTGG-3’) CM31b (5’-CCTGAACAACACGCTCGGA-3’), [65]
Phản ứng PCR được tiến hành tương tự như trên với ngoại trừ là nhiệt độ trong chu trình nhiệt được thiết kế như sau: nhiệt độ biến tính ban đầu ở 94oC trong 3 phút; 35 chu kì của 94oC trong 30 giây, 52oC trong 30 giây và 72oC trong 1 phút 20’; và cuối cùng kết thúc ở 72oC trong 7 phút. Qui trình và nồng độ hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR được trình bày cụ thể trong phụ lục 2.
Giải và phân tích trình tự
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PCR clean up system (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sử dụng làm khuôn trực tiếp cho phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye Terminator v. 3.1, Applied Biosystems) với các cặp mồi 16S-27F/16S-1492R theo chương trình nhiệt như sau: 96°C trong 20 giây, 50°C trong 20 giây và 60°C trong 4 phút. Sản phẩm phản ứng được phân tích trên máy phân tích trình tự tự động ABI Prism 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems).
