1.3.1. Trên thế giới
Bacteriocin từ vi khuẩn biển đang là một chủ đề nghiên cứu hấp dẫn do tiềm năng ứng dụng của chúng trong NTTS như là một chế phẩm sinh học hoặc là chất kháng khuẩn thế hệ mới [43, 70]. Cho đến nay trên thế giới mới chỉ có một số ít nghiên cứu cơ bản về các sinh vật biển sinh bacteriocin hay BLIS được công bố (Hình 1.4) [32].
Hình 1.4. Số lượng bài báo nghiên cứu về bacteriocin trong mỗi chu kỳ 10 năm từ 1949-2010.
Trong đó: “colicin” là các bacteriocin từ E.coli, “microcin” là các bacteriocin rất nhỏ từ enterpbacteria, “LAB bacteriocin” là bacteriocin từ vi khuẩn lactic và “marine bacteriocin” là các bacteriocin có nguồn gốc từ biển.
Bacteriocin từ Vibrio sp.
Bacteriocin biển đầu tiên được phân lập từVibrio harveyi. McCall và Sizemore
Texas. Theo nghiên cứu này khoảng 5% chủng Vibrio spp. có khả năng kháng khuẩn được phát hiện có khả năng sinh bacteriocin. Các bacteriocin này có trọng lượng phân tử cao, được mã hóa trên plasmid và chỉ có khả năng kháng khuẩn đối với các chủng thuộc loài V. harveyi (Bảng 1.4). Do đó, các loại bacteriocin này được gọi là harveyicin [62]. Những nghiên cứu sâu hơn cho biết rằng harveyicin có bản chất protein, bị biến tính khi xử lý với các loại enzyme, và bền nhiệt (không mất hoạt tính kháng khuẩn sau khi được xử lý nhiệt ở 55oC trong 4 giờ [53]. Harveyicin có khả năng cạnh tranh với các loài vi khuẩn trong đường ruột và trong môi trường phù du ở nhiệt độ 4 - 39oC, pH 5 - 9,5 và độ mặn 1,75% - 3,5% [53]. Việc phát hiện ra harveyicin đã khơi mào cho nghiên cứu các loại bacteriocin từ vi khuẩn biển. Phần lớn những nghiên cứu này tập trung vào xác định tiềm năng sử dụng chúng như là một chất kháng sinh thế hệ mới hoặc probiotic.
Các loài Vibrio thường gặp phổ biến trong môi trường nước biển, và được phân lập chủ yếu từ cá và động vật thân mềm. Một vài loài trong số đó có thể là các tác nhân gây bệnh, nhưng đa số khác thì không gây bệnh đến vật chủ. Zai và cộng sự [104] đã phân lập và định danh 50 chủng Vibrio phân lập từ mang và ruột cá da trơn (Arianus thalassinus) khỏe và bị bệnh (Bảng 1.4).
Carraturo và cộng sự [20] đã phân lập được ba chủng vi khuẩn không gây bệnh cho người thuộc chi Vibrio (V. mediterranei 1, V. mediterranei 4, và V. fluvialis) trên hải sản tươi và đông lạnh, nhưng có hoạt tính đối kháng với các tác nhân gây bệnh V.
parahaemolyticus và V. mediterranei trên đĩa thạch. Bản chất protein của chúng được
thể hiện qua sự bất hoạt bởi enzyme proteinase K.
Prasal và cộng sự [72] khi nghiên cứu một vài chủng V. harveyi từ bộ sưu tập của họ đã phát hiện ra bacteriocin được sản sinh từ một chủng V. harveyi (VIB 571). Điều thú vị hơn nữa là chủng này đang được cho là tác nhân gây bệnh ở cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) và cá hồi Đại Tây Dương (Salmon salar) [105]. Bacteriocin từ chủng V. harveyi VIB 571 đã được chứng minh kháng lại bốn chủng có họ hàng gần với nó là V. harveyi, V. fisheri, V. gazogenes và V. parahaemolyticus (Bảng 1.4). Dịch bacteriocin thô được thu bằng kết tủa amonium-sulphate đối với dịch nuôi vi khuẩn sau 72 giờ, bị bất hoạt bởi lipase, proteinase K, pepsin, trypsin, pronase E và SDS (ủ 10 phút, ở 60oC). Mặt khác, hoạt tính kháng khuẩn không bị ảnh hưởng bởi pH [87].
Bảng 1.4. Các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin
Chủng sản xuất Bacteriocin Chủng chỉ thị Nguồn phân lập
Kích thước bacteriocin (kDa) Listonella anguillarum AVP10 Vibriocin AVP 10 Escherichia coli Listonella anguillarum Cá da trơn (Arius thalassimus) khỏe hoặc bị bệnh ?
Vibrio mediterranei BLIS V. parahaemolyticus
V. mediterranei
Hải sản tươi
hoặc đông lạnh 63-65
Vibrio harveyi VIB
571 BLIS V. harveyi V. fischeri V. gazogenes V. parahaemolyticus - ~32 Vibrio harveyi
(Beneckea harveyi SY) Harveyicin SY V. harveyi Đảo Galveston 24
Vibrio vulnificus IW1, BC1, BC2
Vibrio spp. Plesiomonas shigelloides E. coli Mẫu nước ở Wilmington (NC, Mỹ) <10 Vibrio sp. NM 10 BLIS Pasteurella piscicida E. coli, V. vulnificus Enterococcus seriolicida Leiognathus nuchlis <5 Chủng vi khuẩn Gram dương ZM81 Bacteriocin/BLIS Chủng vi khuẩn biển ZM19 Vùng biển mở ở bờ biển Karachi >10
Aeromonas hydrophila BLIS Staphylococcus aureus Nước có thực
vật phù dù ? Pseudoalteromonas sp. X153 Protein kháng khuẩn P - 153 Vibrio Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes, Propionibacterium granulosum Bán đảo Brittany 280
Chủng Vibrio sp. NM 10 được phân lập từ cá biển Leiognathus nuchalis từ
vùng bờ biển đảo Enoshima, Kanagawa, Nhật Bản. Chủng này thể hiện tính kháng mạnh với chủng P. piscicida K-III, nhưng cũng có khả năng ức chế E. coli IAM 1264,
V. vulnificus RIMD 2219009 và Enterococcus seriolicida YT-3 [89]. Bacteriocin từ Vibrio sp. NM 10 đã được xác nhận có bản chất là protein, không bền nhiệt, với trọng
lượng phân tử nhỏ hơn 5 kDa [89].
Shehane và Sizemore [85] đã phân lập được ba chủng vi khuẩn sinh bacteriocin từ các cửa sông gần Wilmington (NC, Mỹ) và phổ kháng khuẩn của chúng cũng được xác định (Bảng 1.4). IW1 ức chế một vài chủng của V. vulnificus; BC1 ức chế một vài chủng của V. vulnificus, V. cholerae và V. parahaemolyticus; và BC2 ức chế tất cả các chủng Vibrio spp., Plesiomonas shigelloides và E. coli thử nghiệm. Bacteriocin IW1
dễ biến tính bởi nhiệt, trong khi đó BC1 bền nhiệt ở mức độ trung bình. BC2 rất bền nhiệt và duy trì hoạt tính của chúng khi đông lạnh, hấp khử trùng hoặc khi xử lý ở các mức pH thấp hoặc cao. Nhóm tác giả khuyến cáo rằng những loại bacteriocin này có thể được sử dụng để tiêu diệt V. vulnificus trong hải sản.
Bacteriocin từ Aeromonas sp. biển
Moro và cộng sự [69] và Messi và cộng sự [63] đã thông báo sự sinh tổng hợp bacteriocin ở loài Aeromonas hydrophilla. Tất cả các chủng Aeromonas hydrophila
trong hai nghiên cứu này thể hiện hoạt tính ức chế chống lại một vài chủng của
Staphylococcus aureus (Bảng 1.4). Messi và cộng sự [63] đã chứng tỏ khả năng ức chế
của chúng đối với Listeria, Streptococcus agalactiae và Lactobacillus sp. Tuy nhiên, không có sự ức chế nào được thể hiện chống lại các chủng vi khuẩn Gram âm được nghiên cứu, bao gồm các loài gần gũi (Aeromonas sobria ATCC 43979, A. caviae
ATCC 13137).
Bacteriocin từ Pseudoalteromonas sp. biển
Longeon và cộng sự [59] nghiên cứu vi khuẩn thu từ bán đảo Brittany và họ tập trung vào chủng Pseudoalteromonas sp. X-153 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao. Sau khi tinh chế, protein kháng khuẩn từ chủng này được xác định có kích thước là 289 kDa, có hoạt tính kháng khuẩn đối với cả các vi khuẩn thuộc nhóm Gracilicutes (Vibrio) và Firmicutes (Staphylococcus epidermidis, Propioni bacterium acnes và P.granulosum).
Bacteriocin từ Firmicutes và vi khuẩnlactic phân lập từ động vật biển
Vi khuẩn Gram dương bao gồm vi khuẩn lactic thường gặp phổ biến trong dạ dày của động vật đẳng nhiệt. Hệ vi sinh vật đường ruột của các con cá khỏe mạnh thường bao gồm các loại vi khuẩn lactic thuộc các chi Streptococcus, Lactobacillus,
Carnobacterium, Leuconostoc [78]. Divercin và piscicocin là hai loại bacteriocin từ Carnobacterium phân lập từ ruột cá đã được miêu tả một cách chi tiết (Bảng 1.5) [74].
Hai loại bacteriocin này thuộc bacteriocin Lớp IIa.
Pirzada và cộng sự [71] phân lập chủng vi khuẩn ZM81, một vi khuẩn Gram dương có tế bào que đa hình, từ khu vực ngoài khơi của Karachi. Bản chất protein của bacteriocin từ chủng vi khuẩn này đã được xác định bởi sự bất hoạt khi xử lý với enzyme pronase và trypsin. Đồng thời, nó không bền nhiệt nhưng bền với dải pH rộng từ 4 - 12.
Bảng 1.5. Bacteriocin từ vi khuẩn lactic được phân lập từ động vật biển
Chủng sản xuất Bacteriocin Chủng bị kháng Vật chủ Kích thước (kDa) Enterococcus faecium LHICA 28.4; 34.5; 40.4; 46 Enterocin P Carnobacterium altaromaticum Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Thịt cá bơn Enterococcus faecium
ALP7 Bac ALP7 L. monocytogenes
Pediococcus
pentosaceus ALP57 Bac ALP57
Bacillus subtilis Enterococcus faecalis Lactobacillus brevis gravensis
Lactobacillus curvatus L. innocua Động vật thân mềm (hàu, vẹm…) <10 Carnobacterium
divergens V41 Divercin V41 L. monocytogenes
Ruột cá Hồi 4509 Carnobacterium piscicola V1 Piscicocin V1a Piscicocin V1b L. monocytogenes Ruột cá hồi vân 4416 4526
Những nghiên cứu gần đây trên 258 chủng vi khuẩn phân lập từ nước và trầm tích ở bán đảo Jucatan cho thấy rằng có 46 chủng thuộc các chi Aeromonas, Bacillus,
Burkholderia, Photobacterium, Pseudomonas, Serratia và Stenotrophomonas có hoạt
tính kháng sinh. Trong đó, 50% hoạt tính kháng sinh này có bản chất là bacteriocin hoặc BLIS [30].
Ngoài ra Wilson và cộng sự [103] đã phân lập được 9 chủng vi khuẩn biển sinh chất kháng khuẩn từ một vài loài động vật không xương sống ở biển (hàu, bọt biển,
nhím biển…) (Bảng 1.5) [103]. Khi xử lý các chất kháng sinh này với proteinase K, các chất kháng khuẩn bị bất hoạt hoàn toàn. Balacázar và cộng sự [15] đã tiến hành phân lập và xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin từ loài cá ngựa (Hippocampus guttulatus). Nghiên cứu này đã phân lập được 3 chủng vi khuẩn (V. harveyi, V. mediterranei và V. paraharmolyticus) có khả năng sinh các chất kháng sinh bacteriocin. Điều đó chỉ ra rằng, sự đa dạng của các loại bacteriocin và BLIS từ vi sinh vật biển đang được quan tâm nghiên cứu.
1.3.2. Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu cơ bản nào về bacteriocin từ vi khuẩn biển đã được công bố [1] cho đến khi nhóm của Nguyễn Văn Duy bắt đầu nghiên cứu từ năm 2012. Các nghiên cứu về bacteriocin chủ yếu tập trung vào các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ thực phẩm lên men, nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm.
Nguyễn Thị Hoài Hà và cộng sự [2] tại Trung tâm Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng
Lactobacillus plantarum L24 phân lập từ nước dưa. Bên cạnh đó, tác giả Hoa Thị Minh Tú và cộng sự [10] cũng đã nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số bacteriocin từ vi khuẩn phân lập từ sữa bò, nhằm hướng tới ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, đồ hộp, sữa tươi…
Các tác giả Lê Thị Hồng Tuyết và Hoàng Quốc Khánh [11] thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật làm chế phẩm probiotic trong nuôi tôm cao sản. Một trong những chủng vi sinh vật được dùng là
Lactobacillus sp. Chế phẩm có tác dụng làm tăng tính ngon miệng, giúp tiêu hoá các
chất dinh dưỡng có trong thức ăn, tăng cường sức đề kháng, phòng ngừa các bệnh đường ruột như nhiễm E. coli, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn có hại, do đó nâng cao năng suất nuôi tôm.
Bên cạnh đó, động vật biển ở các vùng ven biển địa phương đang được coi là nguồn để phân lập các chủng vi khuẩn hữu ích. Thậm chí chúng cũng được coi là nơi để phát hiện ra loài vi khuẩn mới bởi vì các vi sinh vật trong đường ruột của động vật đặc hữu ở các vùng miền địa phương hiếm khi được nghiên cứu đầy đủ của cộng đồng khoa học quốc tế. Đánh giá đa dạng sinh học của vi khuẩn sản sinh bacteriocin có thể cung cấp sự hiểu biết sâu sắc hơn về đặc điểm sinh thái, sinh lý học và tiến hóa của vi sinh vật biển trong sự tương tác với các động vật chủ và vi khuẩn đích. Hơn nữa, ứng
dụng tiềm năng của chúng trong phát triển probiotic sẽ góp phần phòng trừ dịch bệnh do vi khuẩn trong nuôi trồng thủy hải sản.
Nói tóm lại, tuy đã có những nghiên cứu trên thế giới về vi khuẩn biển sinh bacteriocin được phân lập các đối tượng thủy sản, như cá và động vật thân mềm nhưng chủ đề này vẫn còn bỏ ngỏ ở Việt Nam. Hiện nay chưa có nghiên cứu nào trên thế giới và ở Việt Nam về vi khuẩn biển sinh bacteriocin phân lập từ tu hài. Sự thành công của đề tài sẽ cung cấp bộ sưu tập các chủng vi khuẩn mới sinh bacteriocin và góp phần vào hưóng nghiên cứu ứng dụng bacteriocin trong NTTS, từ đó mang đến cho những người nông dân địa phương hy vọng để giảm thiểu tổn thất do dịch bệnh gây ra, góp phần cải thiện chất lượng cuộc sống và bảo vệ môi trường khu vực nuôi.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin phân lập từ Tu hài (Lutraria philippinarum) sống tại vịnh Nha Trang và vịnh Cam Ranh
- Thời gian nghiên cứu: từ 2/ 2012 – 2/ 2013
- Địa điểm nghiên cứu: Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang, số 2 Nguyễn Đình Chiểu, Nha Trang.
2.2. Nguyên vật liệu 2.2.1. Mẫu tu hài 2.2.1. Mẫu tu hài
Mẫu tu hài để phân lập vi khuẩnđược thu tại các trại nuôi thuộc vịnh Nha Trang và Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa. Tại nơi thu mẫu, mẫu được cắt bỏ những phần không cần thiết và thu lấy phần cơ thịt bằng dao, panh vô trùng. Sau đó mẫu được đưa vào nước muối sinh lý vô trùng, rồi vận chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập vi khuẩn tổng số.
Bảng 2.1. Thu mẫu Tu hài phân lập vi khuẩn biển
STT Ngày phân lập Địa điểm thu mẫu Số lượng mẫu (con)
1 27/2/2012 Vịnh Nha Trang 3 2 24/7/2012 Vịnh Nha Trang 3 3 9/10/2012 Vịnh Cam Ranh 3
2.2.2. Chủng vi khuẩn chỉ thị
Các chủng vi khuẩn chỉ thị được sử dụng để thử hoạt tính của các chủng vi khuẩn phân lập được. Các chủng này bao gồm các chủng Enterococcus faecalis B1.1, Vibrio parahaemolyticus C1 và Vibrio alginolyticus V3.3 được lấy từ bộ sưu tập vi sinh vật của
Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang.
Các chủng trên được nuôi cấy trên môi trường TSB, hoặc TCBS, bổ sung 1,5 % NaCl, lắc 180 vòng/phút, ở 37oC.
2.2.3. Hóa chất, môi trường và thuốc thử
a) Môi trường nuôi cấy lỏng TSB (Trypton Soy Broth)
Trypticase pepton: 17 g Phytone pepton :3 g NaCl : 5 g K2HPO4: 2,5 g Glucose : 2,5 g Nước cất: 1 L pH (ở 25oC): 7,3 ± 0,2
Hòa tan 30 g môi trường TSB tổng hợp trong 1000 ml nước cất, chuẩn pH, sau đó đổ môi trường vào các bình tam giác, làm nút bông và bọc giấy bạc, hấp khử trùng ở 121oC trong vòng 15 phút.
b) Môi trường thạch nuôi cấy vi khuẩn tổng số TSA (Trypton soy agar) Môi trường TSA được pha từ môi trường TSB có bổ sung thêm 1,5 % agar. c) Môi trường thạch nuôi cấy TCBS ( Thiosulphate Citrate Bile salts Sucrose) Peptone special : 10 g/l Yeast extrat: 5 g/l
Sodium thiosulphate: 10 g/l Sodium citrate: 10 g/l Sodium cholate: 3g/l Oxgall: 5 g/l
Sucrose: 20 g/l Sodium chloride 10 g/l Feric citrate: 1 g/l Bromo thymol blue: 0,04 g/l Thymol blue: 0,04 g/l Agar: 15 g/l
pH (250C): 8,8 ± 0,2
Hòa tan 89 g môi trường TCBS tổng hợp trong 1000 ml nước tiệt trùng vào bình tam giác sạch. Sau đó làm nút bông, bọc giấy bạc và đun sôi đến khi agar trong môi trường tan hết.
d) Dung dịch nước muối sinh lý
Hòa tan 8,5 g NaCl trong 1 L nước cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút.
e) Thuốc nhuộm Crytal Violet Tím violet : 1 g Rượu ethylic : 1 g Phenol tinh thể : 2 g Nước cất : 100 ml
Hòa tan 1g tím violet vào trong 10 ml cồn (dung dịch 1) Hòa tan 2g phenol tinh thể vào 10 ml nước cất (dung dịch 2)
Trộn chung dung dịch 1 và 2 lại với nhau ta có dung dịch thuốc nhuộm tím violet.
f) Thuốc nhuộm Lugol Iod tinh thể : 1 g KI : 2 g Nước cất : 200 ml
Hòa tan iod vào nước cất, sau đó cho KI vào, bảo quản trong lọ tối màu. g) Thuốc nhuộm Fuchsin
Fuschin kiềm : 1 g Rượu ethylic 95%: 10 ml Phenol tinh thể : 5 g Nước cất : 100 ml
Hòa tan Fuchsin vào trong 10 ml cồn 95% (dung dịch 1) Hòa tan phenol tinh thể vào 100 ml nước cất (dung dịch 2). Trộn đều dung dịch 1 và 2 đem lọc, ta có thuốc nhuộm Fuchsin h) Các enzyme:
Một số enzyme được sử dụng để xác định bản chất hóa học của dịch bacteriocin, bao gồm: α- amylase (Sigma), α – catalase (Sigma), α- chymotrypsin (Sigma), Proteinase K (Sigma), Lipase (Sigma). 2.2.4. Thiết bị chuyên dụng
- Cân phân tích (Shimadzu, Nhật).
- Máy ly tâm (Eppendof Mikrol 120, Đức). - Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam).
- Kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic BA 300, Mỹ). - Máy quang phổ khả kiến (Genesys 20 Thermo)
- Máy lắc vòng (GFL 3005, Đức) - Tủ sấy (Binder, Đức)
- Nồi hấp thanh trùng autoclave (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan). - Lò vi sóng (Panasonic, Hàn Quốc).
- Tủ ấm - Bể ổn nhiệt.
2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phân lập vi khuẩn 2.3.1. Phân lập vi khuẩn