2.2.1. Chuẩn bị nguyên liệu
Rau dền đỏ tƣơi sau khi thu mua đƣợc đem ngay về phòng thí nghiệm, rửa sạch, để ráo. Nguyên liệu có thể dùng để nghiên cứu ngay hay cho vào các túi nilon và bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh để dùng dần. Thời gian bảo quản khoảng 2-5 ngày để tránh ảnh hƣởng đến chất lƣợng chất màu).
2.2.2. Dự kiến quy trình chiết tách anthocyanin từ rau dền đỏ
Quy trình dự kiến chiết tách chất màu anthocyanin từ rau dền đỏ và các yếu tố cần khảo sát đƣợc trình bày trong sơ đồ hình 2.1.
Hình 2.1.Quy trình dự kiến tách chiết chất màu anthocyanin từ rau dền đỏ và các yếu tố cần khảo sát
Giải thích quy trình:
Mục tiêu của bố trí thí nghiệm này là tìm ra chế độ chiết anthocyanin từ rau dền đỏ một cách hiệu quả nhất. Do đó, cần nghiên cứu xác định loại dung môi chiết,
Điều kiện chiết thích hợp - Dung môi?
- Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu?
- Phƣơng pháp chiết? - Nhiệt độ chiết? - Thời gian chiết? - Số lần chiết?
Bảo quản dịch chiết anthocyanin thô cô đặc Xử lý (Bỏ rễ, lá úa, thân cứng, rửa sạch, để
ráo, cắt nhỏ 1-2mm) Chiết
Lọc
Cô đuổi dung môi Rau dền đỏ
tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, phƣơng pháp chiết, nhiệt độ chiết, thời gian chiết, số lần chiết thích hợp đảm bảo hàm lƣợng màu anthocyanin thu đƣợc là cao nhất.
Nguyên liệu
Nguyên liệu dùng để chiết anthocyanin trong thí nghiệm này rau dền đỏ tƣơi.
Xử lý
Rau dền đƣợc loại bỏ rễ, lá úa, thân cứng, rửa sạch, để ráo, cắt nhỏ 1-2 mm.
Chiết
Sau khi cân với một khối lƣợng thích hợp, anthocyanin của rau dền đƣợc chiết bằng dung môi và phƣơng pháp chiết thích hợp đã xác định (tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ, thời gian chiết, số lần chiết) sao cho đạt hàm lƣợng anthocyanin chiết cao và hợp lý nhất.
Lọc
Dịch sau khi chiết xong đƣợc lọc qua giấy lọc để loại bỏ bã chiết và các hợp chất không tan để thu dịch chiết.
Cô đuổi dung môi
Dịch chiết sau đó đƣợc đem cô đuổi dung môi bằng thiết bị cô quay chân không dƣới áp suất thấp (nhiệt độ không quá 700C) để tránh sự phân hủy anthocyanin trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng. Thực hiện cô đuổi nhằm mục đích thu đƣợc dịch sản phẩm thô chứa anthocyannin cô đặc đồng thời thu hồi dung môi tái sử dụng.
Bảo quản dịch chiết anthocyanin cô đặc
Dịch chiết anthocyanin cô đặc đƣợc bảo quản trong lọ thủy tinh có nắp đậy kín và bảo quản trong điều kiện thích hợp.
2.2.3. Xác định điều kiện chiết anthocyanin từ rau dền
Để xây dựng đƣợc quy trình chiết bột màu anthocyanin đạt hiệu quả cao, cần nghiên cứu sự phụ thuộc của hàm lƣợng chất màu anthocyanin chiết đƣợc vào các yếu tố: Tỷ lệ Etanol/H2O; tỷ lệ dung môi/nguyên liệu; phƣơng pháp chiết;
nhiệt độ chiết; thời gian chiết và số lần chiết, trong đó các thông số trên thay đổi nhƣ sau:
- Tỷ lệ Etanol/H2O: Thay đổi từ 0 100% (v/v); bƣớc nhảy: 20% (v/v). - Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 5/1 (v/w); bƣớc nhảy: 5/1 (v/w). - Phƣơng pháp chiết: Phƣơng pháp ngâm chiết; phƣơng pháp siêu âm. - Nhiệt độ chiết: Nhiệt độ phòng (280C); 40; 60; 80; 1000C.
- Thời gian chiết: 10 60 (phút); bƣớc nhảy: 10 phút. - Số lần chiết: 1 4 (lần).
Việc xác định thông số thích hợp đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp thực nghiệm yếu tố từng phần cổ điển (thay đổi 1 yếu tố trong khi cố định các yếu tố còn lại).
2.2.3.1. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ Etanol/H2O thích hợp
Mục đích của thí nghiệm là tìm ra loại dung môi tối ƣu để có thể chiết rút đƣợc lƣợng anthocyanin là cao nhât, tiết kiệm chi phí sản xuất và tạo điều kiện thuận lợi cho các quá trình tiếp theo để tăng hàm lƣợng màu chiết tách. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ Etanol/H2O đƣợc trình bày ở hình 2.2.
Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ etanol/H2O thích hợp
b) Thuyết minh sơ đồ
Để xác định loại dung môi chiết thích hợp cho quá trình tách chiết anthocyanin từ rau dền đỏ, tiến hành thí nghiệm với 6 tỷ lệ dung môi Etanol/H2O khác nhau. Cân chính xác khoảng 1 g nguyên liệu (đã xử lý, trộn đều) cho vào các bình nón 100 ml. Thêm dung môi chiết vào, trong đó cố định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 10/1 (v/w), còn tỷ lệ Etanol/H2O thay đổi lần lƣợt là 0%; 20%; 40%; 60%; 80% và 100% (v/v). Bịt kín các bình nón bằng giấy bạc và túi PE rồi tiến hành chiết bằng cách siêu âm trong 20 phút ở nhiệt độ 400C, chiết 1 lần. Sau đó, lọc lấy dịch chiết rồi đem định mức bằng nƣớc cất đến một thể tích chính xác (D ml) rồi
0% 20% 40% 60% 80% 100% Chiết với Etanol/H2O (tỷ lệ dung môi/nguyên liệu = 10/1) (v/w)
Chọn tỷ lệ Etanol/H2O thích hợp Đo độ hấp thụ, tính hàm lƣợng anthocyanin Lọc Rau dền đỏ Bã Xử lý
đo độ hấp thụ của các dung dịch ở 538 nm. Xác định và so sánh hàm lƣợng chất màu anthocyanin từ đó chọn dung môi chiết thích hợp.
2.2.3.2. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là thông số ảnh hƣởng lớn đến lƣợng thu hồi chất màu. Nếu tỷ lệ này nhỏ quá sẽ không chiết đƣợc chất màu triệt để từ nguyên liệu. Ngƣợc lại, nếu tỷ lệ trên quá lớn sẽ làm loãng chất màu trong dung dịch chiết, ảnh hƣởng đến quá trình tách dung môi và thu nhận chất màu. Vì vậy thí nghiệm đƣợc bố trí để xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp cho quá trình chiết. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đƣợc thể hiện hình 2.3.
a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm
5/1 10/1 15/1 20/1 25/1
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
Bã Xử lý Lọc Đo độ hấp thụ, tính hàm lƣợng anthocyanin Chọn tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu thích hợp Rau dền đỏ
b) Thuyết minh sơ đồ
Cân chính xác 1g nguyên liệu (đã xử lý, trộn đều) cho vào các bình nón 100 ml. Thêm dung môi chiết thích hợp, trong đó tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thay đổi lần lƣợt là: 5/1; 10/1; 15/1; 20/1; 25/1(v/w). Bịt kín các bình nón bằng giấy bạc và túi PE rồi siêu âm trong 20 phút ở nhiệt độ 400C. Lọc lấy dịch chiết, định mức bằng nƣớc cất đến một thể tích chính xác (D ml). Đo độ hấp thụ của các dung dịch ở 538 nm. Xác định và so sánh hàm lƣợng chất màu anthocyanin từ đó chọn tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp.
2.2.3.3. Bố trí thí nghiệm chọn phƣơng pháp, nhiệt độ chiết
Nhiệt độ ảnh hƣởng nhiều đến hàm lƣơng chất màu chiết đƣợc. Trên thực tế, lƣợng chất màu phụ thuộc đồng thời vào bản chất dung môi, nhiệt độ. Do đó, một dung môi có hiệu quả chiết tốt nhất ở nhiệt độ phòng có thể không phải là dung môi chiết tốt nhất ở nhiệt độ cao hơn. Vì vậy, để chọn nhiệt độ chiết thích hợp cần thay đổi đồng thời dung môi và nhiệt độ.
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm chọn dung môi, nhiệt độ đối với các phương pháp chiết khác nhau
Phƣơng pháp chiết
Chiết nhờ siêu âm Ngâm chiết gia nhiệt Etanol/nƣớc 40% (v/v) Nƣớc cất Etanol/nƣớc 40% (v/v) Nƣớc cất Nhiệt độ (0C) 28 28 28 28 40 40 40 40 60 60 60 60 80 80 80 80 - - 100 100
a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm chọn dung môi, nhiệt độ chiết thích hợp
b) Thuyết minh sơ đồ
Đề tài nghiên cứu chiết anthocyanin trong 2 trƣờng hợp sau:
- Ngâm chiết có gia nhiệt, sử dụng dung môi là H2O và etanol 960/H2O, trong đó nhiệt độ thay đổi từ t0
phòng 1000C.
- Siêu âm có gia nhiệt, sử dụng dung môi H2O và etanol 960/H2O, trong đó nhiệt độ thay đổi từ t0
phòng 800C (do thiết bị siêu âm phòng thí nghiệm sử
Ngâm chiết (20 phút):
Dung môi chiêt là Etanol/ H2O 40% (v/v) và nƣớc cất. Nhiệt độ thay đổi theo bảng 2.1.
Chiết có siêu âm (20 phút): Dung môi chiết là Etanol/ H2O 40% (v/v) và nƣớc cất. Nhiệt độ thay đổi theo bảng 2.1.
Chọn dung môi, nhiệt độ, phƣơng pháp chiết thích hợp Xử lý Lọc Đo độ hấp thụ, tính hàm lƣợng anthocyanin Rau dền đỏ Bã
dụng chỉ có thể đạt nhiệt độ tối đa là 800C). Tiến hành:
Cân chính xác khoảng 1 g nguyên liệu (đã xử lý, trộn đều) cho vào các bình nón 100 ml, chia làm 2 lô thí nghiệm:
- Lô TN1: Thêm H2O và etanol 960/H2O (tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp đã đƣợc xác định từ kết quả thí nghiệm 2.2.3.2). Đậy kín, cho vào tủ sấy (đã gia nhiệt đến nhiệt độ xác định) trong 20 phút. Nhiệt độ thay đổi lần lƣợt là:
t0
phòng (mẫu này không đƣa vào tủ sấy) ; 400C; 600C;800C và 1000C.
Sau đó, lấy ra lọc lấy dịch chiết, định mức bằng nƣớc cất đến một thể tích chính xác (D ml). Đo độ hấp thụ của các dung dịch ở 538 nm. Đánh giá hàm lƣợng màu anthocyanin.
- Lô TN2: Tiến hành tƣơng tự lô TN1 nhƣng nhƣng cho vào bể siêu âm trong 20 phút, trong đó nhiệt độ siêu âm thay đổi lần lƣợt là:
t0phòng ;400C; 600C và 800C (Nhiệt độ tối đa của bể là 800C).
Các yếu tố khác đƣợc cố định.So sánh hàm lƣợng màu chiết đƣợc ở từng phƣơng pháp từ đó chọn dung môi và nhiệt độ phù hợp.
2.2.3.4. Bố trí thí nghiệm chọn thời gian chiết
Thời gian chiết là một thông số quan trọng của quá trình. Xác định thời gian chiết chất màu anthocyanin nhằm tránh sự biến đổi chất màu khi gia nhiệt quá dài và giảm chi phí sản xuất cũng nhƣ nhân công lao động.
Hình 2.5.Bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết
b) Thuyết minh sơ đồ
Cân chính xác khoảng 1g nguyên liệu (đã xử lý, trộn đều) cho vào các bình nón 100 ml. Thêm dung môi với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp. Đậy kín bình nón rồi tiến hành chiết bằng phƣơng pháp chiết và ở nhiệt độ thích hợp, trong đó thời gian chiết thay đổi nhƣ sau: 10; 20; 30; 40; 50; 60 (phút). Lọc lấy các dịch chiết, định mức bằng nƣớc cất đến một thể tích chính xác (D ml). Đo độ hấp thụ của các dung dịch ở 538 nm. Xác định và so sánh hàm lƣợng chất màu anthocyanin từ đó chọn thời gian chiết phù hợp.
10 20 30 40 50 60 Chọn thời gian chiết thích hợp Lọc Đo độ hấp thụ, tính hàm lƣợng anthocyanin Xử lý
Chiết với thời gian (phút):
Bã
2.2.3.5. Bố trí thí nghiệm chọn số lần chiết
a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm xác định số lần chiết
b) Thuyết minh sơ đồ
Sau khi xác định đƣợc các thông số chiết chất màu, để đánh giá hàm lƣợng chất màu còn lại trong bã chiết và xác định số lần chiết của mẫu.
Cân chính xác khoảng 1g nguyên liệu (đã xử lý, trộn đều) cho vào các bình nón 100 ml. Tiến hành chiết (sử dụng dung môi, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ, phƣơng pháp và thời gian chiết đã chọn).
1 lần 2 lần 3 lần 4 lần Bã Xử lý Chiết với số lần: Lọc Đo độ hấp thụ, tính hàm lƣợng anthocyanin Rau dền đỏ Chọn số lần chiết thích hợp
Sau mỗi lần chiết, lọc lấy dịch. Lặp lại quá trình chiết nhƣ trên với bã còn lại cho đến khi đạt đƣợc số lần chiết n xác định (n = 1, 2, 3, 4). Gộp lấy dịch chiết thu đƣợc sau n lần chiết của từng mẫu một, định mức bằng nƣớc cất đến một thể tích chính xác (D ml). Đo độ hấp thụ của các dung dịch ở 538 nm. Xác định và so sánh hàm lƣợng chất màu anthocyanin từ đó chọn số lần chiết phù hợp cho mỗi dung môi và phƣơng pháp chiết.
2.2.4. Phƣơng pháp phân tích
2.2.4.1. Xác định thành phần khối lƣợng của rau dền đỏ
Nguyên liệu rau dền đỏ sau khi rửa sạch và để ráo đƣợc chia thành 3 phần: Phần lá tƣơi, thân mềm; phần lá úa và phần thân cứng. Sau đó, cân các phần này và xác định thành phần khối lƣợng của nguyên liệu nhƣ sau:
– Cân rau dền đỏ đƣợc khối lƣợng là mR;
– Phần sử dụng để tách chiết chất màu là phần lá tƣơi, thân mềm, đem cân phần này ta đƣợc khối lƣợng mL.
– Phần bỏ đi là phần lá bị úa, thân cứng có khối lƣợng là mB. Thành phần khối lƣợng của rau dền đỏ đƣợc tính nhƣ sau:
% Lá tƣơi = mR mL *100% % Phần bỏ đi = mR mB* 100% 2.2.4.2. Xác định hàm lƣợng nƣớc của rau dền đỏ
Rau dền tƣơi đƣợc sấy ở 105–1100C đến khối lƣợng không đổi (phụ lục 1).
2.2.4.3. Đo độ hấp thụ ánh sáng của dịch chiết anthocyanin
Sử dụng thiết bị là máy đo quang UV- Vis Cary 50 để đo độ hấp thụ của anthocyanin ở bƣớc sóng 538 nm là do ở bƣớc sóng này độ hấp thụ của anthocyanin là cực đại [6].
2.2.4.4. Xác định hàm lƣợng anthocyanin tính theo độ hấp thụ quang của dịch chiết trong rau dền đỏ
Chiết anthocyanin trong rau dền đỏ bằng nƣớc cất và đo độ hấp thụ của dung dịch anthocyanin tổng ở bƣớc sóng 538 nm, dùng nƣớc cất làm dung dịch so sánh. Sau đó tính hàm lƣợng anthocyanin bằng công thức ở phụ lục 2.
2.2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu nghiên cứu theo phƣơng pháp thống kê, mỗi thí nghiệm làm 3 lần. Kết quả là trung bình cộng của các lần thí nghiệm song song, xử lý số liệu và vẽ đồ thị bằng phần mềm MS Excel 2003.
2.2.6. Khảo sát độ bền màu của dịch chiết anthocyanin từ rau dền đỏ trong các điều kiện bảo quản khác nhau các điều kiện bảo quản khác nhau
Độ bền của một chất màu trong quá trình bảo quản là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến giá trị cảm quan của thực phẩm. Nếu cƣờng độ màu của chất màu giảm nhanh hay bị biến đổi sang màu khác thì sẽ tạo cho ngƣời tiêu dùng cảm giác sản phẩm đó đã bị hƣ hỏng mặc dù sản phẩm đó vẫn còn trong thời hạn sử dụng. Vì vậy, việc nghiên cứu độ bền của chất màu trong các điều kiện bảo quản khác nhau là điều có ý nghĩa quan trọng trƣớc khi quyết định đƣa một chất màu nào đó ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.
Dịch chiết đƣợc cô đặc ở 700C, tốc độ quay 50 vòng/phút và đƣợc bảo quản ở 3 điều kiện khác nhau: Bảo quản ở nhiệt độ phòng, dƣới ánh sáng tự nhiên; bảo quản ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối; bảo quản lạnh (0-40C) trong bóng tối, tiến hành xác định hàm lƣợng chất màu các mẫu sau mỗi tuần bảo quản.
Xác định tỷ lệ hao hụt anthocyanin theo công thức:
% 100 . 1 2 1 G G G Gh Trong đó: Gh : Tỷ lệ hao hụt chất màu
G1: Hàm lƣợng chất màu ban đầu
Khảo sát độ bền màu của dịch chiết anthocyanin từ rau dền đỏ trong các điều kiện bảo quản khác nhau theo sơ đồ hình 2.7.
Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm khảo sát độ bền màu của chất màu anthocyanin từ rau dền đỏ trong một số điều kiện bảo quản khác nhau
1 2 3 4 Bã Xử lý Chiết Lọc Xác định tỷ lệ hao hụt chất màu Rau dền đỏ
Chọn phƣơng pháp bảo quản thích hợp
Cô đuổi dung môi
Bảo quản ở nhiệt độ phòng (25-350C) Dƣới ánh sáng
tự nhiên
Bảo quản ở nhiệt độ phòng (25-350C) Trong bóng tối
Bảo quản ở nhiệt độ lạnh (0-40C) Trong bóng tối Thời gian bảo quản (tuần)
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thành phần khối lƣợng rau dền đỏ
Kết quả xác định thành phần khối lƣợng nguyên liêu của rau dền đỏ đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần khối lượng của rau dền đỏ
Mẫu
Phần lá tƣơi, thân mềm Phần rễ Phần lá úa, thân cứng
Khối lƣợng (g) Tỷ lệ (%) Khối lƣợng (g) Tỷ lệ