1.3.5.1. Chức năng sinh học
Theo nhiều nghiên cứu, anthocyanin là một chất chống oxy hóa có tác dụng bảo vệ các tế bào thực vật khỏi tác hại của các gốc tự do và tia cực tím. Ngoài ra, anthocyanin còn tạo cho các mô thực vật có màu từ đỏ đến tím, tạo nên màu sắc rực rỡ của nhiều hoa, do đó rất quan trọng trong việc thu hút côn trùng. Cyaninidin-3- glucozit là một anthocyanin khá phổ biến trong các loài thực vật cũng đã đƣợc chứng minh là có tác dụng bảo vệ cây chống lại ấu trùng.
b) Đối với người
Tác dụng chống oxy hóa:
Các tác nhân oxy hóa trong cơ thể bao gồm các gốc tự do, oxy nguyên tử, H2O2 và các oxid nitơ sinh ra trong quá trình trao đổi chất. Sự dƣ thừa các tác nhân oxy hóa có thể dẫn đến sự phá hủy và làm rối loạn chức năng của các enzym, màng tế bào và các gen (Stintzing, 2004), do đó có thể gây ra các bệnh viêm nhiễm, tim mạch, ung thƣ, lão hóa (Allen, 2000). Phân tử anthocyanin chứa nhiều nối đôi liên hợp, đồng thời chứa các nhóm hydroxyl ở các vị trí C-3 của vòng C, C-3’,-4’ và -5’ ở vòng B nên rất hiệu quả trong việc bắt giữ gốc tự do và ngắt mạch phản ứng oxy hóa dây chuyền. Vì vậy, các anthocyanin thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Hoạt tính chống oxy hóa của các anthocyanidin mạnh hơn của các anthocyanin tƣơng ứng và hoạt tính này giảm khi số phân tử đƣờng liên kết với anthocyanidin càng nhiều (Wang, 2008). Hoạt tính chống oxy hóa của nhiều anthocyanin có thể tƣơng đƣơng với các chất chống oxy hóa thƣơng mại nhƣ tert-butylhydroquinone (TBHQ), butylated hydroytoluene (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA) và vitamin E (Seeram, 2001).
Khả năng ngăn ngừa bệnh tim mạch
Sự oxy hóa các lipoprotein mật độ thấp (LDL: low-density lipoprotein) tạo ra các mảng bám cholesterol bị oxy hóa trên thành mạch máu, do đó dẫn đến chứng xơ vữa động mạch và kết quả là gây ra các bệnh tim (Aviram, 2000). Các nghiên cứu của Gracia và cs. (1997) đã chứng minh ácc anthocyanin có khả năng ngăn ngừa sự oxy hóa các lipoprotein cũng nhƣ làm giảm sự keo tụ các phân tử
cholestrol trên thành động mạch, do vậy có tác dụng ngăn ngừa các bệnh tim mạch
Khả năng ngăn ngừa bệnh ung thƣ
Hoạt tính ngăn ngừa ung thƣ của các anthocyanin liên quan đến khả năng chống oxy hóa, chống tăng sinh tế bào ung thƣ, tác dụng kháng viêm,.. Nhiều nghiên cứu trên động vật đã cho thấy anthocyanin có hiệu quả ngăn ngừa nhiều loại ung thƣ nhƣ ung thƣ đƣờng tiêu hóa (bao gồm ung thƣ dạ dày, ung thƣ ruột, ung thƣ vòm họng, ung thƣ thực quản), ung thƣ cột sống,…
1.3.5.2. Ứng dụng của anthocyanin
a) Trong công nghiệp thực phẩm
Anthocyanin là sắc tố tự nhiên có khả năng tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho các sản phẩm. Chúng đã đƣợc chứng minh là vừa an toàn cho ngƣời sử dụng vừa có lợi cho sức khỏe. Do đó, anthocyanin ngày càng đƣợc sử dụng nhiều để làm chất tạo màu (mã số E 163) trong nhiều loại thực phẩm nhƣ nƣớc giải khát, rƣợu, thạch rau câu, kem…
b) Trong y học
Anthocyanin còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quí giá nên nó không chỉ để tạo màu trong thực phẩm mà còn đƣợc sử dụng trong y học.
Từ lâu, các anthocyanin đã đƣợc đƣa vào thành phần của các bài thuốc cổ truyền của ngƣời da đỏ Bắc Mỹ, ngƣời châu Âu, Trung Quốc dƣới dạng lá, quả, rễ cây hay hạt phơi khô. Các dịch chiết hay hỗn hợp giàu anthocyanin (tuy không phải ở dạng tinh khiết) cũng đã đƣợc dùng để chữa các bệnh cao huyết áp, sốt, rối loạn chức năng gan, kiết lỵ, tiêu chảy, các bệnh về hệ bài tiết nhƣ sỏi thận, nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu và các chứng cảm lạnh thông thƣờng. Một số nghiên cứu còn cho thấy việc sử dụng các dịch chiết anthocyanin giúp cải thiện thị lực, tăng cƣờng tuần hoàn máu (Konczak, 2004), chống ung nhọt (Cristoni, 1987), bảo vệ các mô khỏi tác hại của tia tử ngoại (Sharma, 2001) và có tác dụng hữu hiệu trong việc điều trị bệnh tiểu đƣờng loại 2 (Jayaprakasam và cs., 2005).
1.3.6. Tình hình nghiên cứu, khai thác và sử dụng anthocyanin tự nhiên [8] 1.3.6.1. Tình hình trên thế giới 1.3.6.1. Tình hình trên thế giới
Trên thế giới chất màu anthocyanin thƣờng đƣợc thu nhận từ dịch chiết của quả nho, vỏ nho, bắp cải đỏ, củ cải đỏ.,… Hỗn hợp anthocyanin sử dụng rộng rãi nhất trong thực phẩm là anthocyanin từ vỏ nho (E163 (i)) và anthocyanin chiết xuất từ quả nho đen (E163 (iii)). Hiện nay, bắp cải đỏ (Brassica oleracea L.) cũng đƣợc xem là nguồn anthocyanin tự nhiên có giá trị do có khả năng trồng với diện tích lớn, có thể thu hoạch quanh năm, tạo ra màu hồng sáng ở pH thấp và màu hồng/tím hoa cà ở pH trung tính, không có mùi lạ, bền với nhiệt và ánh sáng hơn so với các anthocyanin chiết từ các nguồn tự nhiên khác nhƣ vỏ nho, quả nho đen,… .
Trong thực tế anthocyanin chủ yếu đƣợc chiết xuất dƣới dạng thô để sử dụng trong thực phẩm do việc tinh chế anthocyanin khá khó khăn. Sản phẩm anthocyanin thƣơng mại có thể ở dƣới dạng dịch chiết cô đặc hay ở dạng bột khô (bằng cách trộn dịch chiết anthocyanin cô đặc với chất mang thích hợp rồi sấy phun).
Hình 1.11.Một số dạng sản phẩm anthocyanin thương mại [15]
1.3.6.2. Tình hình trong nƣớc
Ở nƣớc ta, điều kiện khí hậu không thuận lợi lắm cho việc phát triển các vùng nguyên liệu truyền thống để sản xuất chất màu anthocyanin nhƣ các nƣớc vùng ôn đới. Gần đây, chúng ta cũng đã di thực và thƣơng mại hóa một số loài thực vật giàu anthocyanin nhƣ nho đỏ, nho đen, bắp cải tím,… Tuy nhiên, với sản
lƣợng còn hạn chế, các nguyên liệu này chủ yếu chỉ dùng làm thực phẩm tƣơi hay đồ uống (rƣợu vang, nƣớc ép quả nho,…).
Việc tách chiết chất màu từ rau dền đỏ còn chƣa đƣợc nghiên cứu rộng rãi mặc dù trong thành phần của rau dền đỏ có chất màu này, do đó đây là cơ sở để em thực hiện đề tài này.
1.4. Tổng quan về các phƣơng pháp chiết [1], [2], [3], [4], [5] 1.4.1. Các khái niệm cơ bản về quá trình chiết 1.4.1. Các khái niệm cơ bản về quá trình chiết
Chiết là quá trình chuyển chất cần chiết rút trong nguyên liệu vào dung môi và đƣợc thực hiện bằng khuếch tán phân tử và khuếch tán đối lƣu.
Khuếch tán phân tử là quá trình khuếch tán tự nhiên tuân theo định luật Frick. Khuếch tán đối lƣu thực chất là quá trình khuếch tán cƣỡng bức đƣợc thực hiện nhờ sự chuyển động tƣơng đối giữa vật liệu và dung môi. Do hệ số khuếch tán đối lƣu lớn hơn nhiều so với hệ số khuếch tán phân tử nên trong quá trình chiết muốn tăng hiệu quả chiết thì phải tăng cƣờng khuếch tán đối lƣu (ví dụ: tăng cƣờng quá trình khuấy đảo).
1.4.1.1. Khuếch tán phân tử
Khuếch tán phân tử là sự chuyển lẫn nhau giữa các phân tử khác nhau. Sự chênh lệch nồng độ càng lớn thì lực khuếch tán của phân tử chất cần chiết từ vùng nồng độ cao tới vùng nồng độ thấp càng lớn. Bề mặt khuếch tán càng lớn lƣợng vật chất khuếch tán theo hƣớng này trong một đơn vị thời gian càng nhiều. Do đó phƣơng trình khuếch tán cơ
bản nhƣ sau:
Trong đó:
d dm
: Tốc độ hòa tan chất cần chiết.
D : Hệ số khuếch tán. dx dc F D d dm . .
F: Diện tích tiếp xúc với chất cần chiết và dung môi
dx dc
: Gradien nồng độ.
Hệ số khuếch tán D là lƣợng vật chất đi qua một đơn vị diện tích trong một đơn vị thời gian khi Gradien nồng độ bằng 1. Hệ số khuếch tán thay đổi theo nhiệt độ, độ nhớt của dung môi và độ lớn của phân tử, có thể dùng công thức của Anhxtanh để biểu thị: M r KT D . . 6 Trong đó : K: Hằng số khuếch tán
M: Độ dính của chất môi giới (dung môi) T: Nhiệt độ tuyệt đối
r: Bán kính phân tử khuếch tán
1.4.1.2. Khuếch tán đối lƣu
Khuếch tán đối lƣu là hình thái di chuyển vật chất trong dung dịch ở phạm vi nhỏ. Sự chênh lệch về nồng độ rất quan trọng với khuếch tán đối lƣu và khuếch tán phân tử, nồng độ chênh lệch càng lớn thì hiệu suất chuyển di từ vùng nồng độ cao tới vùng nồng độ thấp càng cao.
Phƣơng trình cơ bản về khuếch tán đối lƣu:
dc F d dm . .
Trong đó : dm, dc, F có ý nghĩa tƣơng tự nhƣ trong công thức khuếch tán phân tử ở trên, là biểu thị hằng số khuếch tán đối lƣu.
1.4.2. Các phƣơng pháp chiết
Dựa vào cách tiến hành, có thể chia thành các phƣơng pháp chiết sau:
1.4.2.1. Chiết gián đoạn
gian nhất định, khi giữa dung môi và nguyên liệu đạt nồng độ chất cần thiết ở mức độ cân bằng, tiến hành đổ dung môi cũ ra, thay dung môi mới vào. Cứ nhƣ thế cho đến khi chiết hết chất cần chiết. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là đơn giản, dễ thực hiện. Nhƣợc điểm là tốn công, tốn thời gian cũng nhƣ tốn dung môi chiết nên không kinh tế, không phù hợp với quy mô sản xuất lớn.
1.4.2.2. Chiết bán liên tục
Nguyên lý của phƣơng pháp này là dùng nhiều thiết bị chiết gián đoạn bố trí thành một hệ thống liên hợp tuần hoàn nhằm mục đích giảm thời gian chiết, ít tốn công hơn, tiết kiệm đƣợc nhiều dung môi hơn. Đối với phƣơng pháp này quá trình chiết thực hiện theo nguyên tắc dung môi đi từ nơi có nồng độ chất chiết cao đến nồng độ chất chiết thấp.
1.4.3.3. Chiết liên tục
Nguyên lý là ngâm dung môi trong dòng chuyển động cùng chiều hay ngƣợc chiều của dung môi. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là cho hiệu quả kinh tế cao, thích hợp cho sản xuất công suất lớn, áp dụng cho quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, nhƣợc điểm là thiết bị khá phức tạp, chi phí đầu tƣ lớn.
1.4.3. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình chiết
Sự chênh lệch nồng độ chất cần chiết ở nguyên liệu và dung môi phải lớn
Muốn tạo điều kiện cho sự chênh lệch nồng độ lớn cần tạo những yếu tố sau: Nguyên liệu chiết phải có lực hút nhỏ nhất đối với dung môi để tạo ra nồng độ chất cần chiết trong dung môi phía trong nguyên liệu càng cao để quá trình khuếch tán các phân tử chất cần chiết đi ra càng mạnh.
Lợi dụng nguyên lý ngƣợc dòng của dung môi và nguyên liệu để nâng cao độ chênh lệch về nồng độ (trong chiết liên tục). Tỷ lệ dung môi nguyên liệu phải lớn. Tuy vậy cũng chỉ lớn ở mức độ nhất định hợp lý vì nếu tỷ lệ lớn quá sẽ làm nồng độ chất cần chiết thấp, gây khó khăn cồng kềnh trong sản xuất.
Hình thái, tính chất và cấu tạo của tổ chức nguyên liệu:
dung môi càng tăng nên rút ngắn thời gian chiết và chiết triệt để hơn.
Kích thƣớc càng nhỏ thì diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi càng tăng, hiệu suất chiết tăng. Tuy nhiên cũng không nên nhỏ quá vì nó sẽ gây khókhăn cho quá trình phân ly tiếp theo.
Ảnh hƣởng của thời gian và nhiệt độ chiết
Thời gian càng dài thì lƣợng chất khuếch tán tăng, nhƣng thời gian phải có giới hạn. Khi đạt đƣợc mức độ trích ly cao nhất nếu kéo dài thời gian thì sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế.
Nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán và giảm độ nhớt, do đó phân tử chất hòa tan chuyển động dễ dàng khi khuếch tán giữa các phân tử dung môi. Tuy nhiên, nhiệt độ tăng có giới hạn, vì nhiệt độ quá cao sẽ có thể phân hủy chất màu cần chiết và gây khó khăn cho quá trình công nghệ.
Dung môi chiết
Dung môi chiết cần thỏa mãn các điều kiện sau:
Dung môi hòa tan tốt các chất cần chiết mà không hòa tan các chất khác.
Dung môi phải có thành phần hóa học ổn định không gây ra phản ứng phụ với nguyên liệu.
Dung môi không biến đổi thành phần của sản phẩm khi bảo quản
Dung môi có nhiệt độ sôi thấp để dễ dàng tách dung môi ra khỏi chất cần chiết sau khi chiết. Sau khi tách chiết không để lại mùi vị lạ.
Dung môi không ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời, chất lƣợng sản phẩm.
Dung môi khó cháy nổ, an toàn trong sản xuất, không ăn mòn thiết bị chiết.
Dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, có khả năng sử dụng trong sản xuất.
Hiện nay chƣa có dung môi nào đáp ứng đƣợc tất cả các điều kiện trên nhƣng tùy theo điều kiện sản xuất mà ta chọn dung môi chiết tốt nhất.
1.4.4. Vài kỹ thuật chiết hiện đại dùng để chiết xuất chất màu tự nhiên [8] 1.4.4.1. Chiết nhờ siêu âm (Ultrasound-assisted extraction) 1.4.4.1. Chiết nhờ siêu âm (Ultrasound-assisted extraction)
Nguyên liệu đƣợc trộn với dung môi thích hợp rồi chiết bằng siêu âm. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng siêu âm có khả năng phá vỡ màng tế bào của nguyên liệu, do đó giúp cho xâm nhập của dung môi vào bên trong tế bào dễ dàng hơn. Ngoài ra, siêu âm còn có tác dụng khuấy trộn mạnh dung môi, do đó gia tăng sự tiếp xúc của dung môi với chất cần chiết và cải thiện đáng kể hiệu suất chiết.
1.4.4.2. Chiết siêu tới hạn (SFE: Supercritical Fluid Extraction)
Đây là phƣơng pháp chiết đƣợc quan tâm nhiều nhất hiện nay trong lĩnh vực chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguyên liệu tự nhiên nhằm ứng dụng trong công nghiệp dƣợc phẩm và thực phẩm. Phƣơng pháp này cho phép tự động hóa quá trình chiết và hạn chế việc sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại. Dung môi chiết là một chất lỏng ở trạng thái siêu tới hạn. Ở trạng thái này, chất lỏng có những tính chất đặc biệt nhƣ có tính chịu nén cao, khuếch tán nhanh, độ nhớt và sức căng bề mặt thấp… Do đó, nó có khả năng khuếch tán mạnh vào nền nguyên liệu tốt hơn nhiều so với các dung môi thông thƣờng, vì thế làm tăng hiệu suất chiết lên nhiều lần.
1.4.4.3. Chiết dung môi tăng tốc (ASE: Accelerated Solvent Extraction) Đây là một phƣơng pháp chiết mới, cho phép chiết rất nhanh, tự động hóa, hiệu quả và tiết kiệm dung môi. Nguyên tắc của nó tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp chiết Soxhlet cổ điển, ngoại trừ việc quá trình chiết đƣợc thực hiện ở nhiệt độ, áp suất cao (nhƣng vẫn dƣới điểm tới hạn của dung môi sử dụng). Trong phƣơng pháp ASE, nguyên liệu cần chiết đƣợc xay nhỏ, làm khô (thƣờng là đông khô), rồi nhồi vào một ống chiết (extraction cell). Ống chiết này đƣợc đặt trong lò duy trì ở nhiệt độ thích hợp (có thể điều chỉnh từ 40 – 2000C). Dung môi đƣợc bơm vào ống chiết và giữ ở áp suất 10 -20 MPa trong vài phút (static time), sau đó dịch chiết đƣợc đẩy vào một bình hứng bằng một thể tích dung môi mới (flush volume). Quá trình đƣợc lặp lại vài lần (cycles). Cuối cùng, dịch chiết đƣợc đẩy ra bằng một dòng khí trơ
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Có nhiều nguyên liệu chứa anthocyanin, nhƣng trong đề tài này em chọn cây rau dền đỏ do chúng đƣợc trồng rất phổ biến, phƣơng pháp trồng đơn giản, có hàm lƣợng anthocyanin khá cao và chất màu anthocyanin có khả năng ứng dụng cao trong lĩnh vực thực phẩm. Rau dền đỏ đƣợc mua ở chợ Vĩnh Hải- thành phố Nha Trang- Khánh Hòa. Chọn lựa loại rau dền có lá đỏ tía cả hai mặt lá, rau còn tƣơi, không bị dập úa.
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất nghiên cứu 2.1.2.1. Dụng cụ và thiết bị 2.1.2.1. Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ:
- Bình tam giác (100ml), bình định mức (25 ml, 50 ml) - Cốc thuỷ tinh (50 ml, 100 ml)
- Phễu lọc thủy tinh, bình hút ẩm. - Giấy lọc, giấy bạc, , micropipet, pipet.
Thiết bị:
- Cân phân tích ± 0,1 mg (Satorius, Nhật). - Cân kỹ thuật ± 1 g (Việt Nam). - Tủ sấy thƣờng, bếp điện, tủ lạnh trữ mẫu.
- Bể siêu âm Elmasonic S300H (Elma, Đức) với tần số siêu âm 35kHz. - Quang phổ kế UV-VIS Cary 50 (Hache, Đức).