Tại khoa vi sinh:
• Nhuộm Gram, soi trực tiếp.
• Nuôi cấy vào các môi tr−ờng để xác định các loại VK: cầu khuẩn Gr (+), trực khuẩn Gr (-), vi khuẩn kỵ khí và nấm.
• Làm kháng sinh đồ cho các chủng VK sau khi đã xác định đ−ợc các VK gây VPM theo ph−ơng pháp Kirby -Bauer.
2.2.4.1Ph−ơng pháp nhuộm Gram
• Nguyên tắc:
Do sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào nên vi khuẩn Gr (+) sẽ giữ đ−ợc phức hợp tím Gentian - iode không bị tẩy màu bởi alcool, trong khi VK Gr (-) không giữ đ−ợc phức hợp màu này.
• Đọc kết quả:
VK Gr (+) bắt màu tím. VK Gr (-) bắt màu hồng.
2.2.4.2 Ph−ơng pháp cấy phân lập
Cấy mẫu trên môi tr−ờng BA và MC. ủ 370C/ 18 - 24h Sơ đồ quy trình phân lập
BệNH PHẩM DịCH ổ BụNG
Các môi tr−ờng nuôi cấy, phân lập đặc hiệu: thạch máu, thạch Mac - Conkey...
Các kít định danh: API 20E, API 20NE
Các phản ứng sinh hóa đơn lẻ: oxydaza, catalaza, MIU...
Phần mềm định danh: API 20E, API 20NE
2.2.4.3. Kháng sinh đồ
Nguyên tắc (Ph−ơng pháp khuếch tán trên thạch)
KS tẩm vào khoanh giấy với nồng độ thích hợp sẽ khuếch tán ra mặt thạch xung quanh và ngăn chặn sự phát triển của VK. Đ−ờng kính vòng vô khuẩn bị ức chế thể hiện tính nhạy cảm của VK đối với thuốc KS. Tr−ờng hợp không có vòng ức chế có nghĩa là VK kháng lại thuốc KS.
Vật liệu
• Đĩa KS là những khoanh giấy có đ−ờng kính 6mm, đ−ợc tẩm dung dịch thuốc KS với nồng độ tiêu chuẩn.
• KS lựa chọn để nghiên cứu dựa theo:
- H−ớng dẫn của NCCLs (National Commitee for Clinical Laboratory standard).
- Kháng sinh th−ờng phổ biến trong điều trị bệnh nhân nội trú tại Bệnh viện Việt Đức.
• Các khoanh giấy KS đủ tiêu chuẩn để thử tính nhạy cảm với KS của vi khuẩn ái khí (hãng Bio Rad).
-Với Enterobacteriaceae: amoxicillin+a.clavulanic (AMC), ticarcilline + a.clavulanic (TCC), piperacilline + tazobactam (TZP), cephalothin (CF), cefuroxime (CXM), cefotaxim (CTX), cefoperazone + sulbactam (SCF), cefepime (FEP), ertapeneme (ETP), ciprofloxacin (CIP), gentamicin (GM), co - trimoxazole (SXT).
- Với P. aeruginosa: piperacilline + tazobactam (TZP), ceftazidime (CAZ), cefoperazone + sulbactam (SCF), imipenem (IMP), meropenem (MEM), ciprofloxacin (CIP), gentamicin (GM), amikacine (AK), neltimicine (NET), colistin (CS).
- Với Enterococcus: ampicillin (AM), vancomycin (VA), clindamycine (CM), chloramphenicol (C), erythromycine (E), tetracycline (TE), ciprofloxacin (CIP), nofloxacine (NOR).
• Các khoanh giấy KS của hãng AB BIODISK để thử tính nhạy cảm với KS của VK kị khí (E. tests): metronidazole, imipenem, ampicillin/sulbactam, chloramphenicol.
Biện luận kết quả KSĐ
Đo đ−ờng kính kháng khuẩn để đánh giá độ nhạy và kháng của KS đó dựa theo tiêu chuẩn NCCLs. Kết quả KS Đ đ−ợc chia làm 3 mức: nhạy, trung gian và kháng tùy thuộc vào đ−ờng kính vòng vô khuẩn của từng loại KS.
Ph−ơng pháp phát hiện VK sinh ESBL
- Khi kết quả VK đ−ợc trả lời là E coli, Klebsiella và Enterobacter thì đ−ợc làm xét nghiệm phát hiện sinh men ESBL.
- Phát hiện VK sinh ESBL bằng thử nghiệm cộng lực giữa các cephalosporin thế hệ 3, 4 và clavulanat, nếu có cộng lực d−ơng thì ESBL (+).