Để xác định phân loại chính xác của các chủng vi khuẩn phân lập M3.8, M4.9, U1.3 và U3.7, chúng tôi tiến hành giải trình tự gen 16S rDNA của chúng.
Kết quả hình 17 cho thấy trình tự gen 16S rDNA của chủng M3.8 tương đồng 99,9% với đoạn 16S của chủng Bacillus licheniformis_X68416; tương đồng 99,5% với đoạn 16S của chủng Bacillus aerius_AJ831843. Trình tự gen 16S rDNA của chủng M4.9 tương đồng 100% với đoạn 16S của chủng Bacillus licheniformis_X68416; tương đồng 99,6% với đoạn trình tự 16S của chủng Bacillus aerius_AJ831843.
Hình 17. Vị trí phân loại của các chủng M3.8, M4.9 với các loài có quan hệ họ hàng dựa vào trình tự gen 16S rDNA
Kết quả hình 18 cho thấy trình tự gen 16S rDNA của chủng U1.3 tương đồng 99,9% với đoạn 16S của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis subsp spizizenii_AF074970 và tương đồng 99,8% với chủng Bacillus subtilis_AB042061. Trình tự gen 16S rDNA của chủng U3.7 tương đồng 99,8% với đoạn trình tự 16S của vi khuẩn Bacillus velezensis_AY603658 và tương đồng 99,5% với chủng
Bacillus nematotocita_AY820954.
Staphylococcus aureus_X68417
Bacillus cibi_AY550276
Bacillus indicus_AJ583158
Bacillus idriensis_AY904033 100
Bacillus isabeliae_AM503357
Bacillus safensis_AF234854
Bacillus pumilus_AY876289
Bacillus altitudinis_AJ831842
Bacillus aerophilus_AJ831844
Bacillus stratosphericus_AJ831841 100
99 100
Bacillus aerius_AJ831843
Bacillus licheniformis_X68416 M3.8 100 M4.9 80 77
Bacillus sonorensis_AF302118
72
Bacillus atrophaeus_AB021181
Bacillus velezensis_AY603658
Bacillus nematotocita_AY820954
Bacillus amyloliquefaciens_X60605 59
Bacillus vallismortis_AB021198
Bacillus subtilis subsp subtilis _AB042061
Bacillus subtilis_subsp_spizizenii_ AF074970
Bacillus axarquiensis_AY603657
Bacillus malacitensis_AY603656
Bacillus mojavensis_AB021191 26 61 59 79 23 69 100 98 100 100 85 100 54 0.01
Hình 18. Vị trí phân loại của chủng U1.3 và U3.7 với các loài có quan hệ họ hàng dựa vào trình tự gen 16S rDNA
Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng 4 chủng vi khuẩn có khả năng hình thành màng sinh vật mạnh nhất phân lập được từ các khu vực nước thải của các làng nghề đều thuộc chi Bacillus. Chi này bao gồm các vi khuẩn hình que, Gram dương, có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ cao, hình thành bào tử và đa số là không gây bệnh. Nhờ khả năng tạo được các sản phẩm thương mại có giá trị, như hầu hết các protease và amylase, cũng như thao tác di truyền dễ dàng mà các vi khuẩn chi
Bacillus được xem là mô hình nghiên cứu hiệu quả và có tính ứng dụng cao[49]. Sự tạo thành màng sinh vật ở chủng Bacillus subtilis đóng vai trò quan trọng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm, hóa mỹ phẩm
Staphylococcus aureus_X68417
Bacillus cibi_AY550276
Bacillus indicus_AJ583158
Bacillus idriensis_AY904033 100
Bacillus isabeliae_AM503357
Bacillus safensis_AF234854
Bacillus pumilus_AY876289
Bacillus altitudinis_AJ831842
Bacillus aerophilus_AJ831844
Bacillus stratosphericus_AJ831841
99 100
99
Bacillus aerius_AJ831843
Bacillus licheniformis_X68416
Bacillus sonorensis_AF302118 100
Bacillus atrophaeus_AB021181
Bacillus velezensis_AY603658
U3.7
Bacillus nematotocita_AY820954
82
Bacillus amyloliquefaciens_X60605
79
Bacillus vallismortis_AB021198
Bacillus axarquiensis_AY603657
Bacillus malacitensis_AY603656
Bacillus mojavensis_AB021191 78
Bacillus subtilis subsp spizizenii_AF074970
59
U1.3
Bacillus subtilis_AB042061
67 54 79 70 72 100 99 100 98 77 100 66 0.01
[56]. Bằng cách tạo ra hợp chất surfactin trong quá trình tạo màng sinh vật,
B. subtilis giúp các cây trồng có khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh như
Erwina, Pseudomonas, Xanthomonas. Khả năng tạo gramicidin của chủng Bacillus brevis 18-3 có tác dụng làm giảm đáng kể tốc độ ăn mòn kim loại bằng cách ức chế cả hai chủng vi khuẩn D. orientis và L. discophora SP-6 [5]. Mặt khác, khả năng tạo chất hoạt động bề mặt của các chủng vi sinh vật trong quá trình tạo màng cũng làm tăng mức độ nhũ tương hóa và tạo bọt trong chế biến thực phẩm và tạo nhũ hóa cho các sản phẩm mỹ phẩm [80]. Đồng thời, đặc tính này cũng đã mở ra triển vọng mới trong việc chế tạo chất hoạt động bề mặt sinh học hoạt tính cao từ nguồn vi sinh vật ứng dụng cho công nghiệp dầu khí để xử lý các sự cố tràn dầu [6].
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Từ mẫu 75 chủng vi sinh vật phân lập được từ nước thải các làng nghề ở Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn được 8 chủng M1.10, U1.3, A3.3, M3.8, U3.7, M4.3, M4.9 và M4.10 có hoạt tính tạo màng sinh vật cao hơn các chủng còn lại.
2. Tám chủng vi khuẩn phân lập có khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh vật tốt nhất ở 37oC và pH từ 7 - 7,5. Trong số các chủng này, bốn chủng M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 có khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh vật tốt nhất trong môi trường khoáng cơ bản có bổ sung các nguồn cacbon (fructose, rhamnose, glucosamine) và trong môi trường khoáng cơ sở có bổ sung các nguồn nitơ ((NH4)2SO4, cao nấm men) khác nhau.
3. Các chủng M3.8, M4.9 và U1.3 có hoạt tính kháng mạnh đối với E. coli và
Vibrio parahaemolyticus, với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 7 mm và 9 mm; 8 mm và 10 mm; 7 mm và 9 mm; trong khi đó chủng U3.7 có hoạt tính kháng mạnh đối với 3 chủng Staphylococcus aureus, Samonella typhi và Ralstonia solanacaerum với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 7 mm, 7 mm và 8 mm.
4. Những phân tích về đặc điểm hình thái và phân tích gen 16S rDNA của 4 chủng cho phép chúng tôi nhận định 4 chủng M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 là vi khuẩn Gram dương thuộc chi Bacillus. Trong đó, chủng M3.8, M4.9 gần với loài Bacillus licheniformis; chủng U1.3 gần với loài Bacillus subtilis còn chủng U3.7 gần với loài
Bacillus velezensis.
Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về khả năng tạo thành chất hoạt động bề mặt và đặc tính kháng khuẩn của bốn chủng vi khuẩn phân lập M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 để ứng dụng trong công nghệ xử lý nước thải và trong phòng chống dịch hại gây bệnh trên cây trồng.
Tìm hiểu thành phần protein và vai trò của sự điều hòa biểu hiện gen trong quá trình tạo thành màng sinh vật của bốn chủng vi khuẩn phân lập.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt:
1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, Hà Nội.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002), Sinh học phân tử, Nxb Giáo dục, Hà Nội.
3. Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật học, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh:
4. Allison D. G., Gilbert P., Wilson M. (2000), Community ctructure and co-operation in biofilms, Cambridge University Press, Cambridge, England. 5. Bais H. P., Fall R., Vivanco J. M. (2004), “Biocontrol of Bacillus subtilis against
infection of arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production”, Plant Physiology, 134(1), pp. 307-319.
6. Banat I. M. (1995), “Characterization of biosurfactants and their use in pollution removal-state of the art”, Acta biotechnologica, 15, pp. 251-267.
7. Bendinger B., Rijnaarts H. H. M., Altendorf K., Zehnder A. J. B. (1993), “Physicochemical cell surface and adhesive properties of coryneform bacteria related to the presence and chain length of mycolic acids”, Applied and Environmental Microbiology, 59, pp. 3973-3977.
8. Beveridge T. J., Makin S. A., Kadurugamuwa J. L., Li Z. (1997), “Interactions between biofilms and the environment”, FEMS Microbiology Reviews, 20, pp. 291-303.
9. Boyd A., Chakrabarty A. M. (1994), “Role of alginate lyase in cell detachment of
Pseudomonas aeruginosa”, Applied and Environmental Microbiology, 60, pp. 2355-2359.
10. Brading M. G., Jass J., Lappin-Scott H. M. (1995), “Dynamics of bacterial biofilm formation”, Microbial biofilms, Cambridge University Press, Cambridge, pp. 46-63.
11. Brooks W., Demuth D. R., Gil S., Lamont R. J. (1997), “Identification of a
Streptococcus gordonii SspB domain that mediates adhesion to
Porphyromonas gingivalis”, Infection and Immunity, 65, pp. 3753-3758. 12. Characklis W. G. (1990), “Biofilm processes”, Biofilms, Wiley-Interscience,
New York, pp. 195-231.
13. Characklis W. G., Marshall K. C. (1990), “Biofilms: a basis for an interdisciplinary approach”, Biofilms, John Wiley & Sons, New York, pp. 3-15.
14. Costerton J. W., Geesey G. G., Cheng K. J. (1978), “How bacteria stick”,
Scientific American, 238(1), pp. 86-95.
15. Costerton J. W., Ingram J. M., Cheng K. J. (1974), “Structure and function of the cell envelope of gram-negative bacteria”, Bacteriological Reviews, 38(1), pp. 87-110.
16. Costerton J. W., Lewandowski Z., Caldwell D. E., Korber D. R., Lappin-Scott H. M. (1995), “Microbial biofilms”, Annual Review of Microbiology, 49, pp. 711-745.
17. Cowan M. M., Warren T. M., Fletcher M. (1991), “Mixed species colonization of solid surfaces in laboratory biofilms”, Biofouling, 3, pp. 23-34.
18. Czaczyk K., Myszka K. (2007), “Biosynthesis of extracellular polymeric substances (EPS) and its role in microbial biofilm formation”, Polish Journal of Environmental Studies, 16(6), pp. 799-806.
19. Davey M. E., O'toole G. A. (2000), “Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64(B), pp. 847-867.
20. Davies D. G., Parsek M. R., Pearson J. P., Iglewski B. H., Costerton J. W., Greenberg E. P. (1998), “The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm”, Science, 280, pp. 295-298.
21. De Angelis M., Siragusa S., Berloco M., Caputo L., Settanni L., Alfonsi G., Amerio M., Grandi A., Gobbetti M. (2006), “Selection of potential probiotic
lactobacilli from pig feces to be used as additives in pelleted feeding”,
Research in Microbiology, 157, pp. 792-801.
22. De Weger L. A., Van Der Vlught C. I. M., Wijfjes A. H. M., Bakker P. A. H. M., Schippers B., Lugtenberg B. (1987), “Flagella of a plant growth- stimulating Pseudomonas fluorescens strain are required for colonization of potato roots”, Journal of Bacteriology, 169, pp. 2769-2773.
23. Decho A. W. (1990), “Microbial exopolymer secretion in ocean environment: Their role(s) in food web and marine process”, Oceanography and Marine Biology: Annual Review, 28, pp. 73-153.
24. Deflaun M. F., Marshall B. M., Kulle E. P., Levy S. B. (1994), “Tn5 insertion mutants of Pseudomonas fluorescens defective in adhesion to soil and seeds”, Applied and Environmental Microbiology, 60, pp. 2637-2642.
25. Donlan R. M. (2000), “Role of biofilms in antimicrobial resistance”, American Society for Artificial Internal Organs Journal, 46(6), pp. S47-S52.
26. Donlan R. M. (2002), “Biofilms: Microbial life on surfaces”, Emerging Infectious Diseases, 8(9), pp. 881-890.
27. Donlan R. M., Pipes W. O., Yohe T. L. (1994), “Biofilm formation on cast iron substrata in water distribution systems”, Water Research, 28, pp. 1497-1503. 28. Emerson D., Ghiorse W. C. (1992), “Isolation, cultural maintenance, and
taxonomy of a sheath-forming strain of Leptothrix discophora and characterization of manganese-oxidizing activity associated with the sheath”,
29. Espinosa-Urgel M., Salido A., Ramos J. L. (2000), “Genetic analysis of functions involved in adhesion of Pseudomonas putida to seeds”, Journal of Bacteriology, 182, pp. 2363-2369.
30. Fall R., Kinsinger R. F., Wheeler K. A. (2004), “A simple method to isolate biofilm-forming Bacillus subtilis and related species from plant roots”,
Systematic and Applied Microbiology, 27, pp. 372-379.
31. Flemming H. C. (1993), “Biofilm and environmental protection”, Water Science and Technology, 27, pp. 1-10.
32. Fletcher M. (1988), “Attachment of Pseudomonas fluorescens to glass and influence of electrolytes on bacterium-substratum separation distance”,
Journal of Bacteriology, 170, pp. 2027-2030.
33. Fujita M., Tanaka K., Takahashi H., Amemura A. (1994), “Transcription of the principal sigma-factor genes, rpoD and rpoS, in Pseudomonas aeruginosa is controlled according to the growth phase”, Molecular Microbiology, 13, pp. 1071-1077.
34. Geesey G. G. (1990), Biofouling and biocorrosion in industrial water systems: Proceedings of the international workshop on industrial biofouling and biocorrosion, stuttg, Springer Verlag, Berlin, Germany.
35. Geesey G. G. (2001), “Bacterial behaviour at surfaces”, Current Opinion in Biotechnology, 4, pp. 296-300.
36. Gilbert P., Das J., Foley I. (1997), “Biofilm susceptibility to antimicrobials”,
Advances in Dental Research, 11(1), pp. 160-167.
37. Haggag W. (2010), “The role of biofilm exopolysaccharides on biocontrol of plant diseases”, Biopolymers, InTech, pp. 217-184.
38. Haggag W. M. (2007), “Colonization of exopolysaccharide-producing
Paenibacillus polymyxa on peanut roots for enhancing resistance against crown rot disease”, African Journal of Biotechnology, 6(3), pp. 1568-1577. 39. Heukelekian H., Heller A. (1940), “Relation between food concentration and
40. Heydorn A., Nielsen A. T., Hentzer M., Sternberg C., Givskov M., Ersboll B. K., Molin S. (2000), “Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT”, Microbiology, 146, pp. 2395-2407.
41. Hussain M., Wilcox M. H., White P. J. (1993), “The slime of coagulase - negative staphylococci: biochemistry and relation to adherence”, FEMS Microbiology Reviews, 104, pp. 191-208.
42. Jackson D. W., Simecka J. W., Romeo T. (2002), “Catabolite repression of
Escherichia coli biofilm formation”, Journal of Bacteriology, 184, pp. 3406-3410.
43. Jones H. C., Roth I. L., Sanders W. M. (1969), “Electron microscopic study of a slime layer”, Journal of Bacteriology, 99(1), pp. 316-325.
44. Kaplan J. B., Ragunath C., Ramasubbu N., Fine D. H. (2003), “Detachment of
Actinobacillus actinomycetemcomitans biofilm cells by an endogenous beta- hexosaminidase activity”, Journal of Bacteriology, 185, pp. 4693-4698. 45. Kokare C. R., Chakraborty S., Khopade A. N., Mahadik K. R. (2009), “Biofilm:
Importance and applications”, Indian Journal of Biotechnology, 8, pp. 159-168.
46. Korber D. R., Lawrence J. R., Sutton B., Caldwell D. E. (1989), “Effects of laminar flow velocity on the kinetics of surface colonization by mot+ and mot-Pseudomonas fluorescens”, Microbial Ecology, 18, pp. 1-19.
47. Kubota H., Senda S., Nomura M., Tokuda H., Uchiyama H. (2008), “Biofilm formation by lactic acid bacteria and resistance to environmental stress”,
Journal of Bioscience and Bioengineering, 106(4), pp. 381-386.
48. Lamont R. J., Jenkinson H. F. (1998), “Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62, pp. 1244-1263.
49. Lazarova V., Manem J. (1995), “Biofilm characterization and activity analysis in water and wastewater treatment”, Water Research, 29(10), pp. 2227-2245.
50. Lazarova V., Manem J. (2000), “Innovative biofilm treatment technologies for water and wastewater treatment”, Biofilms II: process analysis and applications, Wiley-Liss, New York, United States, pp. 159-206.
51. Lee J. W., Yeomans W. G., Allen A. L., Deng F., Gross R. A., Kaplan D. L. (1999), “Biosynthesis of novel exopolymers by Aureobasidium pullulans”,
Applied and Environmental Microbiology, 65(12), pp. 5265-5271.
52. Lengeler J. W., Drews G., Schlegel H. G. (1999), Biology of the Prokaryotes, Wiley-Blackwell, New Jersey, United States.
53. Leriche V., Sibille P., Carpentier B. (2000), “Use of an enzyme-linked lectinsorbent assay to monitor the shift in polysaccharide composition in bacterial biofilms”, Applied and Environmental Microbiology, 66, pp. 1851-1856.
54. Matsukawa M., Greenberg E. P. (2004), “Putative exopolysaccharide synthesis genes influence Pseudomonas aeruginosa biofilm development”, Journal of Bacteriology, 186, pp. 4449-4456.
55. Mceldowney S., Fletcher M. (1986), “Variability of the influence of physicochemical factors affecting bacterial adhesion to polystyrene substrata”, Applied and Environmental Microbiology, 52(3), pp. 460–465. 56. Morikawa M. (2006), “Beneficial biofilm formation by industrial bacteria
Bacillus subtilis and related species”, Journal of Bioscience and Bioengineering, 101(1), pp. 1-8.
57. Morikawa M., Kagihiro S., Haruki M., Takano K., Branda S., Kolter R., Kanaya S. (2006), “Biofilm formation by a Bacillus subtilis strain that produces γ - polyglutamate”, Microbiology, 152, pp. 2801-2807.
58. National Association of Corrosion Engineers (1976), “The role of bacteria in the corrosion of oil field equipment”, Technical Practices Committee No 3, National Association of Corrosion Engineers, Houston, Texas, pp. 23.
59. Nguyen Q. H., Nguyen T. P. L., Tran T. H. (2011), “Characterization of biofilm-forming bacteria isolated from soil in Vietnam”, VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology, 27(2S), pp. 187-193.
60. Notermans S., Doormans J. A., Mead G. C. (1991), “Contribution of surface attachment to the establishment of microorganisms in food processing plants: A review”, Biofouling, 5, pp. 21-36.
61. O'toole G. A., Gibbs K. A., Hager P. W., Phibbs P. V. J., Kolter R. (2000), “The global carbon metabolism regulator crc is a component of a signal transduction pathway required for biofilm development by Pseudomonas aeruginosa”, Journal of Bacteriology, 182(2), pp. 425-431.
62. O’toole G. A., Kolter R. (1998), “Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development”, Molecular Microbiology, 30, pp. 295-304.
63. O’toole G. A., Kolter R. (1998), “Initiation of biofilm formation in
Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: A genetic analysis”, Molecular Microbiology, 28, pp. 449-461.
64. Oliveira R., Melo L., Oliveira A., Salgueiro R. (1994), “Polysaccharide production and biofilm formation by Pseudomonas fluorescen: effects of pH and surface material”, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2(1-3), pp. 41-46.
65. Otto K., Norbeck J., Larsson T., Karlsson K. A., Hermansson M. (2001), “Adhesion of type 1-fimbriated Escherichia coli to abiotic surfaces leads to altered composition of outer membrane proteins”, Journal of Bacteriology, 183, pp. 2445-2453.
66. Page S., Gaylarde C. (1990), “Biocide activity against Legionella and
Pseudomonas”, International Biodeterioration, 26(2-4), pp. 139-148.
67. Pornsunthorntawee O., Maksung S., Huayyai O. (2009), “Biosurfactant production by Pseudonmonas aeruginosa SP4 using sequencing batch reactors: Effect of oil loading rate and cycle time”, Bioresource Technology
68. Pratt L. A., Kolter R. (1998), “Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili”, Molecular Microbiology, 30(2), pp. 285-289.
69. Ramey B. E., Koutsoudis M., Von Bodman S. B., Fuqua C. (2004), “Biofilm formation in plant-microbe associations”, Current Opinion in Microbiology,