Ứng dụng của màng sinh vật làm giảm sự ăn mòn kim loại
Vi khuẩn gây ra sự ăn mòn kim loại được biết đến là các chủng vi khuẩn khử sulfate Desulfosporosinus orientis và vi khuẩn oxy hóa sắt Leptothrix discophora
SP-6. D. orientis gây ra sự ăn mòn ở gang, thép cacbon, thép không gỉ và một số hợp kim khác. Hằng năm, thiệt hại do sự ăn mòn kim loại gây ra ở Mỹ là 4 - 6 tỷ USD [34]. Vi khuẩn này có chứa enzyme hydrogenase sử dụng hydrogen như một chất cho điện tử để thu nhận năng lượng gây ra hiện tượng ăn mòn điện hóa ở các bề mặt kim loại. Trong khi đó, vi khuẩn L. discophora SP-6 oxy hóa sắt, tự nó không gây ra sự ăn mòn đáng kể thép nhẹ (thép ít cacbon), nhưng khi có sự kết hợp
với D. orientis và Paenibacillus polymyxa 10401 thì tốc độ ăn mòn thép nhẹ sẽ tăng lên rất lớn [28]. Nghiên cứu của Morikawa [56] cho thấy sự hình thành màng sinh vật ở chủng Bacillus brevis 18-3 đã tạo ra gramicidin làm giảm đáng kể tốc độ ăn mòn kim loại bằng cách ức chế cả hai chủng vi khuẩn D. orientis và L. discophora
SP-6.
Trong công nghiệp lên men
Trong các bồn lên men ở quy mô công nghiệp, màng sinh vật là hình thức hiệu quả để giữ lại sinh khối vi sinh vật [47].
Sau mỗi mẻ lên men, các tế bào ở dạng tự do khó có khả năng giữ lại trong các bồn lên men. Do đó, mỗi khi tiếp tục một quy trình mới lại phải bổ sung thêm một lượng sinh khối nhất định và đợi thời gian để vi sinh vật có thể sinh trưởng, phát triển tới một nồng độ nhất định mới. Quy trình này gây tốn kém ở khâu nguyên liệu đầu vào cũng như mất thời gian vận hành.
Ngược lại, khi đã được bám giữ trên bề mặt giá thể bằng mạng lưới màng sinh vật sinh khối vi sinh vật có thể được giữ lại một cách có hiệu quả sau mỗi mẻ xử lý cũng như tái sử dụng được ở những lần xử lý tiếp theo mà không cần phải bổ sung thêm vi sinh vật cũng như đợi thời gian phát triển.
Ứng dụng trong công nghiệp dầu khí
Nghiên cứu khả năng tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học (biosurfactant) hoạt tính cao từ chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, được phân lập từ nguồn nước thải nhiễm dầu [67] mở ra triển vọng ứng dụng trong công nghiệp dầu khí với các mục đích như nâng cao hệ số thu hồi dầu, xử lý môi trường, làm chất phân tán và nhũ hóa cặn dầu.
Nghiên cứu về màng sinh vật đã và đang là lĩnh vực thu hút sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học, giúp chúng ta hiểu rõ hơn về tác hại cũng như lợi ích ứng dụng của màng sinh vật trong đời sống. Tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu thu nhận được từ các công trình khoa học nước ngoài. Tài liệu về màng sinh vật ở Việt Nam còn tương đối ít và nghiên cứu về màng sinh vật còn chưa nhiều, chưa sâu. Đề tài nghiên cứu của chúng tôi với mục đích tạo thêm cơ sở dữ liệu khoa học về các
chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật từ môi trường nước thải giàu nguồn cacbon ở các khu vực làng nghề và nhà máy sản xuất và đưa ra một số ứng dụng theo hướng xử lý nước thải môi trường.
Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu
2.1.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu
Với mục tiêu phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật và ứng dụng trong xử lý nước thải cũng như ức chế các vi sinh vật gây hại, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn và lấy mẫu nước thải tại một số khu vực ô nhiễm làng nghề ở Việt Nam. Mẫu được lấy vào thời điểm các buổi sáng trong ngày, chứa trong các ống falcon đã khử trùng rồi đem về phòng thí nghiệm để phân tích. Cụ thể, tại các địa điểm sau:
Thứ nhất, nguồn nước thải tại làng miến Lại Trạch - Yên Phú - Yên Mỹ - Hưng Yên: Hệ thống thoát nước và hồ lắng của làng miến chứa lượng nước thải lớn lẫn cặn bột và bã bột dong. Mẫu nước thải được lấy tại các hồ lắng này.
Thứ hai, nguồn nước thải tại làng bún Phú Đô - Mễ Trì - Từ Liêm - Hà Nội: Toàn bộ nước thải của quá trình làm bún được thải trực tiếp ra các cống, rãnh của cả làng. Do vậy, khu vực nước thải làng nghề nơi chúng tôi lấy mẫu có một màu trắng đục, chua và hôi.
Thứ ba, nguồn nước thải tại nhà máy sản xuất bia - Viện Công nghiệp thực phẩm - Thanh Xuân - Hà Nội: Nguồn nước thải được sử dụng là nước thải của xưởng bia - Viện Công nghiệp Thực phẩm đã được tách cặn thông qua bể lắng sơ bộ. Nguồn nước thải có thành phần COD 2500 - 3000 (mg/l), BOD5 1500 - 2000 (mg/l), pH 4,5 - 5,5. Chỉ số COD cao chủ yếu là do trong thành phần nước thải có chứa nhiều tinh bột và các chất hữu cơ.
2.1.2 Vi sinh vật kiểm định
Các vi sinh vật kiểm định được sử dụng trong đề tài bao gồm:
Staphylococcus aureus; Ralstonia solanacaerum; Samonella typhi; E. coli; Vibrio parahaemolyticus do bộ môn Vi sinh thuộc trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội phối hợp cung cấp.
2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
2.2.1 Môi trường nuôi cấy
Môi trường LB (Luria - Bertani broth hay Luria broth):
Tryptone 10g
Cao nấm men 5g
NaCl 10g
Nước cất 1 lít
Môi trường LB là môi trường thường được sử dụng trong việc nuôi cấy các chủng vi khuẩn hiếu khí. Môi trường có đầy đủ các chất dinh dưỡng nguồn cacbon, nitơ cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển.
Môi trường khoáng cơ bản:
(NH4)2SO4 2g MgSO4.7H2O 0,2g NaH2PO4.H2O 0,5g CaCl2.2H2O 0,1g K2HPO4 0,5g Nước cất 1 lít
Môi trường khoáng cơ sở:
KH2PO4 1,36g CaCl2 0,03g Na2HPO4 2,13g MgSO4.7H2O 0,2g FeSO4.7H2O 0,01g Glucose 10g Nước cất 1 lít
Các môi trường đều được khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 120 phút. Các hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu, đánh giá khả năng tạo màng sinh vật như các loại đường Fructose (Sigma - Mỹ); Arabinose (Merk - Đức), Mannose (Merk - Đức), NaCl (Công ty cổ phần Hóa chất Đức Giang)… đều đạt độ tinh sạch cho mục đích nghiên cứu.
2.2.2 Máy móc, thiết bị
Nồi khử trùng (ALP - Nhật Bản) Máy lắc ổn nhiệt (Satorius - Đức) Tủ cấy vi sinh vật (Aura vertical - Ý) Cân điện tử 2 số lẻ (Kern - Đức) Cân phân tích (Presica - Thụy Sỹ) Máy đo pH (Horiba - Nhật Bản)
Máy đo mật độ quang học (Bionate - Anh) Tủ ấm (Memmert - Đức)
Tủ sấy (Memmert - Đức)
Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA RET - Đức) Kính hiển vi điện tử quét JSM - 5421LV (Nhật)
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn
Vi khuẩn được phân lập từ các mẫu nước thải, sử dụng phương pháp pha loãng mẫu trong nước cất vô trùng.
Mẫu sau khi pha loãng được cấy gạt dịch ở các nồng độ từ 10-1, 10-2 đến 10-5 trên các đĩa petri chứa môi trường LB - thạch. Các đĩa sau khi cấy trải được nuôi cấy trong tủ ấm với nhiệt độ 37oC trong thời gian 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện và được quan sát sau thời gian ít nhất là 24 giờ. Các khuẩn lạc sau khi phát triển sẽ được tách riêng rẽ và được nuôi cấy trên môi trường phù hợp hoặc LB có bổ sung thạch.
2.3.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng
Sau khi phân lập riêng rẽ trên các đĩa petri chứa môi trường LB - thạch, các vi sinh vật được cấy truyền trên môi trường thạch nghiêng thích hợp đã được khử trùng.
Các ống thạch nghiêng sau khi cấy được nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ 37oC trong thời gian 24 giờ. Các ống giống sau khi phát triển sẽ được lấy ra và cho vào tủ lạnh giữ ở 4oC. Hàng tháng, các ống giống được lấy ra và cấy truyền lại vào môi trường mới.
Phương pháp bảo quản giống lâu dài
Các chủng vi sinh vật sau khi phân lập riêng rẽ được bảo quản lâu dài trong môi trường glycerol theo tỷ lệ 1:1 ở nhiệt độ lạnh sâu -80oC.
2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng tạo màng sinh vật của các
chủng vi sinh vật
Trong môi trường dinh dưỡng thích hợp và điều kiện nuôi cấy tĩnh, một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật trên bề mặt giá thể. Việc phát hiện, quan sát sự tạo thành màng sinh vật được thực hiện bằng phương pháp nhuộm màu với dung dịch tím kết tinh 1% (w/v). Tím kết tinh (crystal violet hay Gentian violet) là một thuốc nhuộm hóa học triarylmethane có công thức phân tử là C25H30N3Cl, công thức cấu tạo là [C(C6H4N(CH3)2)3]Cl - Tris (4-(dimethylamino) phenyl) methylium chloride. Dung dịch tím kết tinh 1% có khả năng bắt màu với các tế bào sống, sự thay đổi về cường độ màu thể hiện mức độ và số lượng của các tế bào vi sinh vật.
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của O’Toole và cộng sự [62] Khuẩn lạc các chủng vi sinh vật sau khi tách riêng rẽ sẽ được nuôi cấy kích hoạt trong bình tam giác chứa 10ml môi trường LB lỏng trong 24 giờ ở 37oC sao cho mật độ tế bào OD620 ở vào khoảng 0,3 - 0,4. Hút 100l dịch nuôi cấy vi khuẩn
bổ sung vào 700l LB lỏng trong các ống eppendorf đã khử trùng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC.
Sau 24 giờ, các dịch nuôi cấy được loại bỏ khỏi các ống eppendorf. Đánh giá mật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp đo mật độ quang học ở bước sóng 620 nm (OD620) dịch nuôi cấy vi khuẩn.
Phương pháp quan sát khả năng tạo thành màng sinh vật:
Mỗi ống eppendorf được rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng. Sau đó mỗi ống eppendorf được bổ sung 1ml dung dịch tím kết tinh 1% và giữ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Dung dịch nhuộm tím kết tinh sau đó được loại bỏ, rửa sạch 2 lần bằng nước cất và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên thành ống với tím kết tinh.
Mật độ tế bào trong màng sinh vật tạo ra được đánh giá bằng độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57]: Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất, các tinh thể tím bám trên thành eppendorf được hòa tan trong 1ml etanol 70o. Mật độ tế bào trong màng sinh vật được xác định bằng cách đo độ hấp thụ OD 570 nm.
2.3.4 Tối ưu hóa các điều kiện tạo màng sinh vật
Mỗi chủng vi sinh vật tùy theo đặc tính sinh học của chúng chỉ có thể tạo thành màng sinh vật tốt nhất ở những điều kiện thích hợp về nhiệt độ, pH, các nguồn carbon, nitơ.
2.3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường
Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật sẽ được nghiên cứu về khả năng phát triển trong các điều kiện nhiệt độ môi trường khác nhau. Các nhiệt độ được lựa chọn nghiên cứu là: 20oC, 30oC, 37oC, 40oC, 50oC và 60oC. Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng tạo thành màng sinh vật của các chủng vi sinh vật nghiên cứu bằng cách đo độ hấp thụ OD 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57].
2.3.4.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy
Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật sẽ được nghiên cứu về khả năng phát triển trong các điều kiện pH môi trường khác nhau. Các giá trị pH môi trường khác nhau được lựa chọn nghiên cứu là: pH 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5. Sau 24 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào trong màng sinh vật tạo ra được đánh giá bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng OD 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57].
2.3.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ cacon trong môi trường
Bổ sung các nguồn cacbon vào môi trường khoáng cơ bản với nồng độ 1%. Các nguồn carbon được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm:
Đường 5 cacbon: Arabinose, Fucose, Rhamnose
Đường 6 cacbon: Glucose, Mannose, Fructose, Galactose Đường đôi: Saccharose, Lactose
Polysaccarit : Tinh bột
Khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút
Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật sẽ được nuôi cấy trong môi trường khoáng cơ bản có bổ sung các nguồn cacbon khác nhau, điều kiện tĩnh, ở 37oC. Sau 24 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào trong màng sinh vật tạo ra được đánh giá bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng OD 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57].
2.3.4.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ trong môi trường
Bổ sung các nguồn nitơ khác nhau vào môi trường khoáng cơ sở với nồng độ 0,1%. Chỉnh pH tới 7,0 - 7,2.
Các nguồn nitơ được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm:
(NH4)2SO4, NaNO3, KNO3, (NH4)2C6H5O7, Pepton, Cao nấm men. Khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút
Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật sẽ được nuôi cấy trong môi trường khoáng cơ sở có bổ sung các nguồn nitơ khác nhau với điều kiện tĩnh, ở 37oC. Sau 24 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào trong màng sinh vật tạo ra được đánh giá bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng OD 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57].
2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng tạo chất hoạt động bề mặt
Khả năng tạo thành chất hoạt động bề mặt của các chủng vi sinh vật được đánh giá bằng mức độ nhũ tương hóa dung dịch dầu ăn của dịch nuôi cấy tế bào thông qua chỉ số E24 (emulsion index) theo phương pháp của Suwansukho và cộng sự [80].
Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật sẽ được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, lắc với tốc độ 160 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ 37oC. Sau đó, dịch nuôi cấy lắc được ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ cặn tế bào, thu lấy phần dịch nổi.
Bổ sung 2ml dầu ăn vào 2ml dịch vi khuẩn thu được sau khi ly tâm trong các ống nghiệm nhỏ, đường kính 1cm.
Vortex với tốc độ cao trong 1 phút
Sau 24 giờ, lấy ra đo mức độ nhũ tương hóa.
Chỉ số nhũ tương hóa E24 được tính theo công thức sau:
E24 = [(chiều cao cột nhũ tương hóa)/(tổng chiều cao cột)] × 100% [80].
2.3.6 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn
Khả năng kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật thử nghiệm đối với các chủng vi khuẩn kiểm định được xác định theo phương pháp của De Angelis và cộng sự [21].
Các chủng vi sinh vật (bao gồm các chủng vi sinh vật đã phân lập được thử nghiệm khả năng kháng khuẩn và các chủng vi sinh vật kiểm định) được nuôi cấy qua đêm trong môi trường LB lỏng trên máy lắc với tốc độ 160 vòng/phút, ở 37oC.
Sau đó, dịch nuôi cấy vi sinh vật thử nghiệm được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ hoàn toàn tế bào vi khuẩn. Dịch lắc của vi khuẩn kiểm định được cấy trải trên các đĩa môi trường LB - thạch với thể tích 100l. Các lỗ được đục với đường kính 6mm trên các đĩa thạch.
Dịch lọc của từng chủng vi sinh vật thử nghiệm được cho vào các lỗ thạch với thể tích 30l. Các đĩa thạch được ủ qua đêm ở 37oC. Quan sát và chụp ảnh trên các đĩa thạch.
Khả năng kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật thử nghiệm được xác định dựa vào đường kính vòng kháng khuẩn (D) xuất hiện xung quanh lỗ thạch.
D = D - d D: đường kính vòng vô khuẩn (mm)
d: đường kính lỗ thạch (mm).
2.3.7 Phương pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc:
Dựa vào sự khác biệt giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Vi khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm thấu ngăn cản sự thất thoát của tím kết tinh. Ban đầu, vi khuẩn được nhuộm bằng tím kết tinh sau đó được xử lý bằng iot để tăng độ giữ màu. Sau đó được tẩy màu bằng cồn làm co