nhân PLB.
* Xác định nồng độ hormon tối ưu cho sự biệt hĩa PLB từ mẫu lá của các chồi thu được trong thí nghiệm 1
Thí nghiệm này được tiến hành trên cả 5 giống, mỗi giống chọn lá cắt nhỏ cĩ kích thước 5 x 5 mm, mỗi nghiệm thức 30 mảnh lá, thí nghiệm được lập lại 3 lần
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHSTTV lên sự hình thành PLB từ lá
Theo Tanaka và Sakanishi (1980), việc nuơi cấy những mảnh lá chỉ thực hiện thành cơng với những mẫu lá non, cịn các lá trưởng thành khơng cĩ khả năng tạo PLB.Theo phương pháp này, PLB cĩ thể tạo ra khi nuơi cấy các mẫu lá in vitro được hình thành từ các chồi của phát hoa trên mơi trường MS, mỗi mẫu tạo ra trung bình khoảng 3,8 PLB tại mặt cắt của mẫu lá. Sự tạo PLB cịn phụ thuộc đoạn cắt của lá, thường những đoạn cuối lá cĩ khả năng tạo PLB cao hơn. Mơi trường thích hợp cho việc nuơi cấy là mơi trường MS cải tiến, Hyponex Japan (6,5-6-19), những giống thích hợp là Phalaenopsis hybrid.
So-young Park và cộng sự (2002) đã nghiên cứu vai trị của chất điều hịa sinh trưởng thực vật, nồng độđường và ảnh hưởng của ánh sáng đến việc cảm ứng tạo PLB
Mơi
trường Auxin cytokinin Loại
Tỉ lệ mẫu tạo PLB (%) GIỐNG 1 Tỉ lệ mẫu tạo PLB (%) GIỐNG 2 Tỉ lệ mẫu tạo PLB (%) GIỐNG 3 Tỉ lệ mẫu tạo PLB (%) GIỐNG 4 Tỉ lệ mẫu tạo PLB (%) GIỐNG 5 MSII1 NAA (1 mg/l) Adenine (10mg/l) 0 0 0 0 0 MSII2 NAA (1 mg/l) BA (10mg/l) 9,67±0,58 5,67±2,08 0,33±0,05 0,67±0,05 0 MSII3 NAA (1 mg/l) Adenine (10 mg/l) + BA (10mg/l) 30,0±1,0 15,67±3,06 2,33±0,58 2,67±0,58 0
NAA (5,4µM), sucrose 30 g/l cho số mẫu lá tạo PLB rất cao (85%) và trung bình tạo được khoảng 12 PLB trên một mẫu lá.
Trong thí nghiệm này chúng tơi chỉ khảo sát ảnh hưởng của BA ở nồng độ 10 mg/l kết hợp với NAA 1 mg/l và adenine 10 mg/l (Tanaka và Sakanishi, 1980) so sánh với việc sử dụng chỉ adenine hoặc chỉ BA kết hợp với NAA (bảng 3).
Sau 10 tuần nuơi cấy chỉ thu được kết quả từ giống số 1(Dtps Taida Salu) và giống số 2 (Dtps Taida Firebird) là 2 giống cĩ số lượng mẫu lá tạo PLB nhiều nhất, giống số 3 và 4 thì tạo PLB ít hơn hay những mảnh lá chỉ cĩ phản ứng với mơi trường (lá vênh lên, cĩ những đốm trắng ở rìa mép mà khơng tạo được PLB), cịn ở giống thứ 5 (Mãn Thiên Hồng) lá hố đen và chết sau 2 tuần nuơi cấy.
Các PLB được hình thành chủ yếu từ các mảnh lá ở phần gốc và ít ở các mảnh lá phần đỉnh. Lá và thân mặc dù cĩ những nét giống nhau về hình thái giải phẫu nhưng khác nhau về cách sinh trưởng và cách sắp xếp các mơ. Lá cĩ sinh trưởng tận cùng hữu hạn. Do đĩ, để cĩ sự phát sinh hình thái mới, đỉnh lá cũng cần phải cĩ sự phân hố của các tế bào nhu mơ để trở về trạng thái mơ phân sinh.
Sau một thời gian, các chồi xuất hiện xung quanh mép lá (nơi cĩ vết thương) tiếp tục phát triển trong khi phần mơ lá ban đầu bị hoại đi. Phiến lá ban đầu được sử dụng như nguồn dinh dưỡng khởi đầu cho PLB và cho chồi sau này nhưng hệ thống mạch của chồi được hình thành thì hồn tồn độc lập với hệ thống mạch của mơ mẹ. Mơi trường cĩ bổ sung 10 mg/l BA thì cĩ PLB hình thành. Tuy nhiên tỉ lệ hình thành PLB trên mỗi mẫu ở mơi trường này rất ít.
Trong mơi trường nếu chỉ cĩ adenine thì hồn tồn khơng cĩ PLB hình thành. Nhưng trong mơi trường cĩ sự hiện diện của cả hai 2 loại cytokinin thì sự tạo PLB là nhiều nhất. Ðiều này cĩ thể giải thích là: do adenine là tiền chất của hormone thực vật do đĩ khơng đủ khả năng để kích thích mơ lá biệt hố thành PLB, khi cĩ sự hiện diện của BA trong mơi trường thì PLB được hình thành và khi đã cĩ sự hình thành PLB thì adenine cĩ tác dụng để tăng sinh PLB .
* Xác định nồng độ hormon tối ưu để nhân nhanh PLB.
Ở 2 giống (Dtps. Taida Salu, giống số 1; Dtps. Taida Firebird, giống số 2) số lượng PLB tạo ra nhiều nhất nên chúng tơi sử dụng PLB của 2 giống này để thực hiện thí nghiệm.
Mỗi nghiệm thức được nuơi cấy với 3 bình, mỗi bình chứa 10 PLB. PLB được lựa chọn đồng cỡ đều nhau và chưa hình thành chồi, được cắt ngang làm đơi và nuơi cấy trong mơi trường MS 1/2 cĩ bổ sung BA và NAA ở những nồng độ khác nhau, 30 g/l đường sucrose, 15% nước dừa, 1g/l than hoạt tính, 8 g/l agar, pH = 5,8
Sau 8 tuần nuơi cấy ghi nhận kết quả số lượng PLB tạo thành
Bảng 3.4 : Ảnh hưởng của chất điều hồ sinh trưởng thực vật lên sự nhân nhanh PLB từ một PLB ban đầu Mơi trường NAA-BA (mg/l) PLB tạo thành Giống 1 Tình trạng PLB Giống 1 PLB tạo thành Giống 2 Tình trạng PLB Giống 2 NB1 0,5-1 0,77±0,19 f Rất ít 1,11±0,38 e Ít NB2 0,5-2 4,22±0,51 d Nhỏ, vàng 3,33±0,58 d Vàng xanh NB3 1-1 6,77±0,51 c Nhỏ, vàng 5,44±0,38 c xanh NB4 1-2 8,56±0,19 b Lớn, vàng xanh 7,22±0,19 b xanh
NB5 1-3 13,89±0,96 a Lớn, vàng xanh 11,5±0,38a xanh
NB6 1-4 8,33±0,67 b Nhiều chồi, xanh 3,88±0,84 d Chồi hình thành
NB7 2-1 1,77±0,19 e Nhiều chồi 1,11±0,51 e thành, cĩ rễ Chồi hình Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức p=0,05.
Các PLB bị cắt làm đơi tiết rất nhiều phenol nên dễ làm đen mẫu và gây chết mẫu, do đĩ khi cắt phải chọn lựa những PLB đủ lớn, dùng dao bén để khơng làm dập mẫu. Dùng acid citric vơ trùng để rửa mẫu cắt, làm giảm lượng phenol trên mẫu do vết thương tiết ra.
Ở nghiệm thức NB1 (MS1/2 + 0,5mg/l NAA + 1mg/l BA )PLB hình thành rất ít do lượng chất ĐHSTTV chưa đủđể kích thích hình thành PLB ở mẫu bị cắt.
Khi tăng lượng chất ĐHSTTV thì thấy lượng PLB tạo thành và tăng dần khi tăng lượng chất ĐHSTTV. Ở nghiệm thức NB5 (MS1/2 + 1mg/l NAA + 3mg/l BA) cho thấy PLB phát triển tốt ở cả 2 giống (kích thước to cĩ màu xanh nhạt hơi vàng).
Ở nghiệm thức NB7 (MS1/2 + 2mg/l NAA + 1mg/l BA) khi tăng lượng NAA lên thì thấy ở PLB cĩ sự hình thành rễ và lượng PLB giảm hẳn, và chồi xuất hiện. Điều này là do Auxin ở nồng độ thấp (phối hợp với cytokinin) giúp tăng trưởng chồi non và khởi tạo mới mơ phân sinh ngọn chồi từ nhu mơ, Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ và cả sự tăng trưởng của rễ này (Bùi Trang Việt, 2000)
* Khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLB
Để xác định loại đường thích hợp cho sự nhân nhanh PLB của 2 giống số 1 và số 2, chúng tơi khảo sát ảnh hưởng của 2 loại đường glucose và sucrose lên sự nhân nhanh PLB trên mơi trường MS 1/2 bổ sung BA 3 mg/l và NAA 1 mg/l, 2 loại đường sucrose và glucose ở các nồng độ khác nhau tùy theo nghiệm thức.
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của 2 loại đường lên sự nhân PLB
Mơi trường Sucrose - Glucose (g/l) Số lượng PLB tạo thành của giống 1 Tình trạng PLB giống 1 Số lượng PLB tạo thành của giống 2 Tình trạng PLB giống 2 SG1 30 – 0 13,11±0,38c Chồi 12,00±0,58c Xanh SG2 25 – 5 13,66±0,33c Chồi 12,56±0,38c Xanh SG3 20 – 10 15,44±0,19b ít chồi 13,88±0,51b Xanh
SG4 15 – 15 16,88±0,51a Cĩ nhilơng hút ều 15,44±1,02a Xanh
SG5 10 – 20 13,44±0,19c Vàng 11,55±2,91c Xanh
SG6 5 – 25 5,88±0,84d Vàng 6,80±2,2d Xanh
Nghiên cứu của Tokuhara và Masahiro (2003) đã chứng minh ảnh hưởng rất đáng kể của các nguồn carbohydrate khác nhau lên sự hình thành PLB từ huyền phù tế bào của cây lan Hồ Điệp Doritaenopsis New Toyohashi. Trong nghiên cứu này cho thấy nồng độ đường Glucose 58,4 mM cho sự hình thành PLB nhiều nhất sau 8 tuần nuơi cấy. Trong khi đĩ trong mơi trường chứa maltose cĩ xuất hiện PLB sau 1 tháng nuơi cấy, tuy nhiên lượng PLB rất ít chỉ bằng 8% lượng PLB thu được trên mơi trường chứa Glucose. Trường hợp mơi trường chứa sorbitol cũng tạo được một ít PLB và callus sau 8 tuần nuơi cấy. Khi nuơi cấy lượng huyền phù tế bào của cây Doritaenopsis New Toyohashi trên mơi trường chứa đường sucrose, callus hình thành rất nhiều và khơng cĩ sự xuất hiện của PLB. Dựa vào nghiên cứu trên, thí nghiệm ảnh hưởng của hai loại đường và sự kết hợp của chúng lên sự nhân nhanh PLB được thiết kế, kết quả được nêu trong bảng 5.
Khác với kết quả của Tokuhara và Masahiro (2003), ởđây khi sử dụng chỉ một loại đường Glucose trong mơi trường nuơi cấy, PLB tạo thành rất ít. Điều này cĩ thể giải thích là do mẫu cấy sử dụng trong thí nghiệm này là PLB chứ khơng phải là dịch huyền phù tế bào, thêm vào đĩ yếu tố khác nhau về giống khiến cho kết quả khác nhau như trên giữa hai nghiên cứu. Theo George( 1993), khi sucrose được bổ sung vào mơi trường nuơi cấy, nĩ sẽ bị phân hủy thành 2 loại đường đơn (glucose và fructose) do sự phĩng thích của enzyme ngoại bào trong quá trình nuơi cấy invitro và điều này làm gia tăng áp suất thẩm thấu trong mơi trường. Vì vậy cần phải ghi nhận rằng sự khác nhau trong ảnh hưởng của glucose và sucrose lên sự hình thành PLB trong thí nghiệm này cĩ thể khơng chỉ bởi sự khác nhau về thành phần đường trong quá trình nuơi cấy mà cịn là do sự thay đổi áp suất thẩm thấu do sự phân hủy sucrose thành 2 loại đường đơn.
Mặc dù vậy, khi thay đổi nồng độ đường và sự kết hợp của hai loại đường cho thấy chúng cĩ ảnh hưởng đáng kể lên sự nhân nhanh PLB từ nguồn PLB ban đầu. Trong đĩ ở sự kết hợp giữa 15 g/l Sucrose và 15 g/l Glucose cho lượng PLB hình thành là cao nhất. Ởđây dễ dàng nhận thấy sự tương quan giữa nồng độđường sucrose và glucose đến sự nhân nhanh PLB, khi nồng độ đường sucrose cao nhất và khơng cĩ glucose, lượng PLB tạo thành khoảng 13 PLB; tiến hành giảm nhẹ lượng sucrose xuống cịn 25 g/l và thêm vào 5 g/l glucose cho thấy cĩ sự tăng nhẹ lượng PLB hình
thành. Tiếp tục giảm lượng sucrose và tăng glucose, PLB hình thành tiếp tục gia tăng và đạt mức cao nhất ở nồng độ sucrose 15 g/l và glucose 15 g/l. Tiếptục giảm sucrose và tăng lượng glucose, sự hình thành PLB giảm dần và thấp nhất ở nồng độ 30 g/l glucose và khơng cĩ sucrose. Tĩm lại, trong thí nghiệm này sự kết hợp giữa hai loại đường sucrose và glucose cho sự nhân nhanh PLB tốt nhất là ở nồng độ 15 g/l sucrose và 15 g/l glucose.