Rotor (1949) là người đầu tiên tiến hành nuơi cấy các chồi ngủ trên trục phát hoa của Lan Hồ Ðiệp. Về sau phương pháp này được hồn chỉnh thêm và được xem là bước khởi đầu cho vi nhân giống các lồi Lan. Các chồi bên của phát hoa biểu hiện 3 kiểu tăng trưởng: vẫn ở trạng thái ngủ, phát triển thành chồi dinh dưỡng, phát triển thành phát hoa thứ cấp.
Nhân giống Hồ Điệp qua phương pháp tạo chồi bằng nuơi cấy chồi ngủ trên phát hoa
Phương pháp này được Intuwong và cộng sự, 1972 cải tiến dựa trên phương pháp mà Rotor đã sử dụng, và các chồi ngủđược nuơi trên mơi trường Vaccin-Went cải tiến.
Ưu điểm chính của phương pháp này là khơng gây hại cây mẹ. Tuy nhiên phương pháp này cho hệ số nhân rất hạn chế do khơng cĩ sự hình thành callus. Do đĩ việc tiếp tục cải tiến quy trình và hệ số nhân là một việc làm cần thiết.
Một số chồi trên phát hoa của Hồ Điệp khơng phát triển thành chồi nhưng lại hình thành 1 khối callus (Tse và cộng sự, 1971; Hackett và cộng sự, 1973). Chồi bất định hình thành trên bề mặt callus và phát triển thành chồi. 12 chồi con cĩ thể hình thành trong 6 tháng trên 1 đốt. Điều này đã mở ra hướng mới trong việc cải thiện hệ số nhân giống in vitro Hồ Điệp qua phương pháp cảm ứng callus. Việc bổ sung NAA vào mơi trường Knudson C khơng thích hợp cho việc hình thành callus, trong khi đĩ khi bổ sung NAA vào mơi trường MS cho thấy cĩ ảnh hưởng tốt lên sự hình thành callus và tái sinh chồi.
Nhân giống Lan HồĐiệp quy mơ lớn qua nuơi cấy mơ lá của chồi in vitro tái sinh từ chồi ngủ trên phát hoa
Nhiều nghiên cứu về việc nhân giống vơ tính Lan Hồ Điệp qua mơ lá đã được thực hiện bởi M. Tanaka và cộng sự tại Đại Học Osaka, Nhật Bản (Tanaka et al., 1974; Tanaka và Sakanishi, 1977, 1980, 1985). Những thí nghiệm bước đầu được tiến hành bằng cách sử dụng lá mới ra của cây trưởng thành và mẫu lá từ những cây phát triển từ hạt. Lá của cây trưởng thành khơng cĩ sự hình thành của PLB trong khi đĩ mẫu lá của những cây in
vitro cịn rất non phát triển từ hạt cĩ sự hình thành PLB. Khả năng hình thành PLB sẽ
giảm đi khi tuổi của cây cho mẫu lá tăng lên. Phương pháp được nêu ngắn gọn ở đây
được phát triển dựa trên mẫu lá cĩ nguồn gốc từ chồi in vitro phát triển từ chồi ngủ trên phát hoa (Tanaka và Sakanishi, 1977, 1980).
Cắt phát hoa ra thành từng đốt chứa chồi ngủ. Các đốt này được xử lý với dung dịch calcium hypochlorite 7% cĩ chứa 0,1% chất giữ ẩm Tween-20. Tiếp theo rửa chúng ba lần bằng nước vơ trùng và cắt bỏ phần lá bắc bao bên ngồi chồi ngủ. Sau đĩ những đốt này lại được cắt lần nữa sao cho chiều dài mẫu chỉ cịn khoảng 1 – 2 cm, cấy vào các ống nghiệm chứa mơi trường Vacin-Went cải tiến cĩ bổ sung 2,5 ppm BAP. Các mẫu lá lấy từ
chồi tái sinh từ chồi ngủ được nuơi cấy trên mơi trường MS cải tiến để tạo PLBs. Sau đĩ PLBs được nhân nhanh trong mơi trường Vacin-Went lỏng cĩ chứa 20% nước dừa (Tanaka và Sakanishi, 1978).
Phương pháp tạo PLBs từ các đoạn cắt đốt phát hoa của Hồ điệp cũng cho kết quả
tốt như phương pháp dùng các phần cắt từ lá. Hai phương pháp trên đã được cơng bố
trong các nghiên cứu bởi Haas-Von Schmude (1983, 1985).
Đặt các đốt chứa chồi ngủ vào mơi trường lỏng MS cải tiến và lắc ở tốc độ 100 vịng/phút trong nhiều tuần. Các đốt chứa chồi ngủ cịn lại được nuơi cấy trên mơi trường tương tự nhưng là mơi trường rắn. Chồi ngủ trong mơi trường nuơi cấy lỏng sẽ phát triển thành PLB trong khi trên mơi trường rắn sẽ tạo ra các chồi mới.
Cắt lấy mẫu lá từ các chồi mới tái sinh, nuơi cấy các mẫu lá một lần nữa trên cùng mơi trường. PLBs sẽ xuất hiện dọc theo các cạnh rìa, trên đỉnh của mẫu lá. Các PLBs này tiếp tục được cắt và nuơi cấy lắc trong mơi trường lỏng MS cải tiến như mơ tảở trên. Sau khi PLBs phát triển trong mơi trường lỏng, chúng được chuyển sang mơi trường rắn để tái sinh thành cây. PLBs khơng cĩ chrorophyll trong tối nhưng chuyển sang màu xanh và phát triển bình thường khi được chiếu sáng. Với phương pháp này cĩ thể sản xuất hơn 30000 cây con từ một phát hoa của Hồđiệp Babette “Symphony” trong vịng 3 năm.
Nhân giống HồĐiệp số lượng lớn bằng nuơi cấy phần lĩng của phát hoa
Cĩ rất nhiều quy trình trong nhân nhanh Hồ điệp trong những năm gần đây, trong
đĩ, chồi ngủ lấy từ phần đốt phát hoa thường được dùng làm nguồn nguyên liệu (Fu, 1979a; Kushnir và Budak, 1980; Yoneda và cộng sự, 1983).
Theo một hướng khác, nhân nhanh HồĐiệp bằng nuơi cấy các lát mỏng thu nhận từ phần lĩng giữa hai đốt của phát hoa đã được nghiên cứu bởi Lin (1986).
Một số nghiên cứu khác
Vào năm 2000, Young và cộng sựđã tiến hành khảo sát khả năng ứng dụng của mơt số hệ thống nuơi cấy Bioreactor trong việc nhân giống qui mơ lớn cây Lan HồĐiệp, trong
đĩ (PLBs) được hình thành trên mẫu cấy lá in vitro được dùng làm mẫu cấy trong hệ
thống nuơi cấy bioreactor. Hệ thống nuơi cấy ngập liên tục (bioreactor hình cột và hình cầu) và hệ thống nuơi cấy ngập tạm thời (cĩ hay khơng màng lọc than) được sử dụng để
khoảng 0,5 hay 2 đơn vị thể tích khí trên đơn vị thể tích mơi trường trong một phút đều thu được sản lượng sinh khối tương tự. PLB cĩ nguồn gốc từ nuơi cấy trong các bioreactor được chuyển sang mơi trường rắn Murashige-Skoog, Vacin-Went, Knudson C, Lindemann và Hyponex. Trong đĩ mơi trường Hyponex là mơi trường thích hợp cho việc tái sinh PLB thành cây con với 83% PLB tái sinh thành cây con trong mơi trường.
Sau đĩ Tokuhara và Masahiro (2001) đã cơng bố nghiên cứu về sự hình thành callus và nuơi cấy huyền phù tế bào Hồ Điệp từ đỉnh sinh trưởng của chồi in vitro tái sinh từ
chồi ngủ trên phát hoa, kết quả của nghiên cứu này cho thấy 73% mẫu cấy đỉnh sinh trưởng của chồi HồĐiệp nuơi cấy từ chồi ngủ trên phát hoa hình thành được callus phát sinh phơi sau 7 tháng nuơi cấy trên mơi trường New Dogashima Medium (NDM) chứa 0,5 µM α-naphthaleneacetic acid (NAA), 4,4 µM 6-benzylaminopurine và 29,2 mM
đường sucrose. Nồng độ đường này được tăng lên tới 58,4 mM sau 4 tháng từ khi bắt đầu nuơi cấy. Các callus được cấy chuyền thành cơng trong hệ thống nuơi cấy huyền phù trong mơi trường NDM lỏng cĩ bổ sung 5,4 µM NAA và 58,4 mM đường sucrose. Bằng cách giảm lượng đường trong mơi trường xuống cịn 29, 2 mM những tế bào cĩ thể tái sinh thành cây qua một quá trình phát trình như các cây HồĐiệp tái sinh từ hạt. Tỷ lệ biến dị soma của 6 trong 8 giống Hồ Điệp thí nghiệm nhỏ hơn 10%. Kết quả này cho thấy cĩ khả năng ứng dụng nuơi cấy callus phát sinh phơi và hệ thống nuơi cấy huyền phù tế bào như là một cơng cụ và nguồn nguyên liệu trong việc vi nhân giống Lan HồĐiệp.