Loan
Mục đích : Bước đầu thiết lập hệ thống nuơi cấy vơ trùng, các bước tiến hành khử trùng dụng cụ và thiết bị nuơi cấy. Tiến hành nuơi cấy thử nghiệm
Phương pháp:
Lắp ráp thiết bị và cho máy vận hành khơng cĩ mẫu chỉ cĩ mơi trường, theo dõi tỉ lệ nhiễm, tìm nguyên nhân và đưa ra các biện pháp khắc phục sự nhiễm của hệ thống. Sau đĩ chúng tơi thử nghiệm nuơi cấy với mẫu cấy là các chồi lên từ PLB của Giống HồĐiệp số 1 Dtps. Taida salu. Các bình Plantima chứa thể tích mơi trường 200 ml được sử dụng. Cho vào mỗi bình 20 chồi, và đặt hệ thống bơm hoạt động theo chu kỳ và tần xuất định sẵn như bơm cho dung dịch ngập mẫu trong 2 phút, nghỉ 6 giờ.
2.4 Nội dung 4: Nghiên cứu sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima của Đài Loan
Vật liệu: - Các cụm PLB của Giống Hồđiệp Số 1 (Dtps. Taida Salu) được sử dụng cho thí nghiệm trong hệ thống Plantima
Mơi trường nuơi cấy: : MS 1/2 cĩ bổ sung BA 3mg/l, NAA 1mg/l, nước dừa 10%, pepton 1g/l và PVP 1g/l, sucrose 15g/l, glucose 15g/l.
2.4.1 Thí nghiệm 4.1: Khảo sát mật độ nuơi cấy, thể tích mơi trường lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima. nhanh PLB trong hệ thống Plantima.
+ Cho PLB với các mật độ: 2g, 4 g, 6g, 8g vào các bình Plantima cĩ thể tích mơi trường 200 ml và cho hệ thống bơm hoạt động theo tần suất định sẵn như bơm cho dung dịch ngập mẫu trong 5phút, nghỉ 2 giờ
+ Từ thí nghiệm về mật độ PLB nuơi cấy chọn mật độ thích hợp nhất cho kết quả nhân PLB tốt và và phát triển đủ khơng gian bình Plantima để làm thí nghiệm về thể tích mơi trường ở các mức : 150, 200 và 250 ml. Tần suất ngập chìm là ngập 5 phút trong chu kỳ 2 giờ
Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 5 bình Plantima và được lập lại ít nhất 2 lần Đối chứng : 1,5 g PLB được nuơi trên mơi trường thạch trong các bình tam giác 250 ml cĩ thể tích mơi trường là 50 ml
2.4.2 Thí nghiệm 4.2: Khảo sát tần suất ngập chìm của mẫu cấy cấy lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima nhanh PLB trong hệ thống Plantima
Sử dụng mật độ và thể tích tối ưu trong thí nghiệm 4.1 để khảo sát ảnh hưởng của các tần suất ngập chìm lên sự nhân PLB : Ngập 10 phút trong chu kỳ 1 giờ; ngập 5 phút trong chu kỳ 2 giờ, ngập 10 phút trong chu kỳ 2 giờ.
2.5 Nội dung 5: Nghiên cứu tái sinh chồi từ PLB trong hệ thống Plantima của Đài Loan Đài Loan
Vật liệu : - Các PLB của giống HồĐiệp số 1 (Dtps. Taida Salu) được sử dụng cho các thí nghiệm của nội dung 5
Mơi trường nuơi cấy:MS1/2 cĩ bổ sung nước dừa 15%, pepton 2g/l, PVP 0.5g/l, dịch chiết khoai tây 30g/l, sucrose 20g/l.
2.5.1 Thí nghiệm 5.1: Khảo sát mật độ PLB, thể tích mơi trường nuơi cấy lên tái sinh chồi từ PLB trong hệ thống Plantima sinh chồi từ PLB trong hệ thống Plantima
+ Khảo sát mật độ PLB: 20,30,50 PLB được sử dụng cho các bình Plantima cĩ thể tích mơi trường 200 ml, tần suất ngập chìm là ngập 3 phút trong chu kỳ 6 giờ
+Khảo sát thể tích: Sử dụng mật độ tối ưu đã khảo sát trong thí nghiệm trên với thể tích mơi trường thay đổi 150 ml, 200 ml, 250 ml, tần suất ngập mẫu : ngập 3 phút trong chu kỳ 6 giờ.
Chỉ tiêu theo dõi là sự phát triển của chồi từ PLB, màu sắc, chiều dài, chiều rộng của lá trong vịng 8 tuần.
2.5.2 Thí nghiệm 5.2: Khảo sát thời gian ngập và tần suất ngập của mẫu cấy lên tái sinh chồi từ PLB trong hệ thống Plantima tái sinh chồi từ PLB trong hệ thống Plantima
Sử dụng mẫu ở mật độ và thể tích tối ưu trong thí nghiệm 5.1 để khảo sát ảnh hưởng của các tần suất ngập chìm: ngập 3 phút trong chu kỳ 4 giờ; ngập 3 phút trong chu kỳ 6 giờ, ngập 3 phút trong chu kỳ 8 giờ.
Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 5 bình Plantima và được lập lại ít nhất 2 lần Đối chứng : 10 PLB được nuơi trên mơi trường thạch trong các bình tam giác 250 ml cĩ chứa thể tích mơi trường là 50 ml
2.6 Nội dung 6: Nghiên cứu sự phát triển của cây con trong hệ thống Plantima của Đài Loan của Đài Loan
2.6.1 Thí nghiệm 6.1: Khảo sát ảnh hưởng thể tích mơi trường, IBA, mật độ nuơi cấy lên sự ra phát triển của cây con trong hệ thống Plantima. cấy lên sự ra phát triển của cây con trong hệ thống Plantima.
Mẫu cấy là những chồi được tách ra từ quá trình tái sinh chồi, chồi lúc cấy vào cĩ chiều dài lá khoảng 9 mm, chiều rộng lá khoảng 3 mm, chiều cao thân khoảng 10 mm, khơng cĩ rễ. Theo dõi kích thước lá, màu sắc, chiều dài và số lượng rễ trong vịng 10 tuần.
Mơi trường nuơi cấy là mơi trường MS1/2 cĩ bổ sung nước dừa (15%), pepton (2g/l), PVP (0,5g/l), dịch chiết khoai tây (30g/l), sucrose (20g/l), IBA(0,5mg g/l), pH 5,8.
Mẫu đối chứng được nuơi trong mơi trường thạch trong bình tam giác 500 ml: 10 mẫu/bình
2.6.2 Thí nghiệm 6.2: Khảo sát thời gian ngập và tần suất ngập của mẫu cấy lên sựphát triển của cây con trong hệ thống Plantima phát triển của cây con trong hệ thống Plantima
Sử dụng mẫu ở mật độ và thể tích tối ưu trong thí nghiệm 6.1 để khảo sát ảnh hưởng của các tần suất ngập chìm: ngập 3 phút trong chu kỳ 4 giờ; ngập 3 phút trong chu kỳ 6 giờ, ngập 3 phút trong chu kỳ 8 giờ.
Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 5 bình Plantima và được lập lại ít nhất 2 lần.
2.7 Chuyển cây con ra vườn ươm
Mục đích: Theo dõi tỉ lệ sống sĩt và phát triển của các cây con cĩ nguồn gốc nuơi cấy trong bình Plantima và bình tam giác khi mang ra ngồi vườn ươm
Phương pháp: Các cây con cĩ bộ rễ khỏe mạnh thu được từ thí nghiệm ra rễ trên hệ thống Plantima và bình tam giác được lấy ra và rửa sạch, sau đĩ được trồng trong các vỉ nhựa với giá thể là dớn.
Trong tuần lễđầu phun sương nước cho cây con nhiều lần trong ngày để giữẩm cho cây, kết hợp phun B1 2 lần /tuần. Sau đĩ phun phân bĩn NPK 30-10-10 2 lần/ tuần. Theo dõi tỉ lệ sống và sự phát triển của cây con trong vườn ươm.
Các thí nghiệm thuộc nội dung 1 được thực hiện tại phịng thí nghiệm CNSH Thực vật trường Đại học Khoa học tự nhiên và tại Trung tâm Cơng nghệ sinh học
Các thí nghiệm thuộc nội dung 2,3,4,5,6 được thực hiện tại phịng thí nghiệm CNSH thực vật Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, Cây số 1900 Quốc lộ 1A, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12
Để đảm bảo điều kiện vơ trùng tương đối, các thí nghiệm trên hệ thống ngập chìm tạm thời được thực hiện trong một phịng nuơi riêng với điều kiện như sau:
Nhiệt độ : 25 ± 20C. Độẩm trung bình : 80 – 85%. Thời gian chiếu sáng : 12 giờ/ngày.
2.9 Xử lý số liệu
Số liệu trong các bảng được thống kê bằng chương trình Statistical Program Scientific System (SPSS) phiên bản 11.5 cho Windows. Sự khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức p=0.05 của các giá trị được biểu hiện bằng các mẫu tự khác nhau kèm theo sau số trung bình và sai số chuẩn.
PHẦN 3 KẾT QUẢ & THẢO LUẬN
3.1 NỘI DUNG 1: Thu thập mẫu thiết lập mơi trường và điều kiện thích hợp để vi nhân giống
3.1.1 Thí nghiệm 1.1: Thiết lập mơi trường tạo chồi in vitro từ các mắt ngủ của phát hoa. hoa.
* Xác định nồng độ chất khử trùng thích hợp cho việc tạo nguồn mẫu in vitro.
Sau 14 ngày nuơi cấy, ghi nhận kết quả những mẫu sạch khơng bị nhiễm khuẩn và nấm (mẫu cịn xanh khoẻ mạnh, khơng bị vàng, khơng bị hố đen, mắt ngủ vẫn cịn xanh khơng bị trắng do javel).
Bảng 3.1: Tỉ lệ % mẫu sống sau xử lý
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức p=0,05. Ở nồng độ javel 1:7 tỉ lệ nhiễm cao, điều này cho thấy nồng độ javel này quá thấp khơng đủđể diệt vi sinh vật.
Ở nồng độ javel 1:6 số lượng mẫu sạch tăng lên, do nồng độ javel cao hơn đã diệt được vi sinh vật. Tỉ lệ mẫu nhiễm khuẩn giảm hẳn chỉ cịn nhiễm do nấm là chủ yếu (vì ở nồng độ này vẫn chưa thích hợp để diệt được hồn tồn bào tử nấm).
Ở nồng độ javel 1:5 số mẫu sạch thu được cao nhất, ở nồng độ này javel đã đủ khả năng diệt hầu hết các vi sinh vật kể cả bào tử của nấm mốc.
Ở nồng độ javel 1:4 số mẫu sạch thu được cao hơn so với ở nồng độ javel 1:5, nhưng do nồng độ javel cao nên đã làm vàng và chết mẫu, cuối cùng tỉ lệ sống của mẫu giảm so với ở nồng độ 1:5.
Qua thí nghiệm trên chúng tơi rút ra kết luận là: ở nồng độ javel 1:5, mẫu được khử trùng trong 25 phút là điều kiện thích hợp để khử trùng mẫu. STT Nồng độ Javel Trung bình mmẫu ẫu sống/ 15 Tmỉ lẫệu s % sống ố Tình trạng mẫu 1 1:7 1,33 ± 0,58 8,9 ± 3,8 c Mẫu còn xanh 2 1:6 6,67 ± 1,53 44,5 ±10,2 b Mẫu còn xanh 3 1:5 14,00 ± 1,00 93,3 ± 6,7 a Mẫu còn xanh 4 1:4 7,67 ± 3,06 51.1 ± 20.3 b Mẫu bị vàng
* Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA lên sự hình thành chồi ở phát hoa
Chúng tơi khảo sát chung cả 5 giống lan Hồ Điệp trong thí nghiệm này mỗi nghiệm thức cĩ 50 mắt ngủ của đủ 5 giống.
Dùng nhánh phát hoa đã nở hồn tồn để cĩ đường kính lớn, chiều dày của lớp nhu mơ, số lượng của bĩ gỗ và bĩ libe nhiều. Sự hình thành nhiều bĩ mạch gĩp phần vận chuyển các chất dinh dưỡng và các chất đồng hố để nuơi mầm sau nầy. Hơn nữa, cây sau khi trổ hoa thì chúng ta biết được màu sắc, chất lượng hoa của cây mẹ một cách chính xác, đây là việc cần thiết khi nhân giống vơ tính (Võ Thị Bạch Mai, 1996).
Chọn những phát hoa to khỏe khơng bị thương tổn, cắt rời những mắt ngủ của cả 5 giống cho đủ số lượng, phần phát hoa sử dụng chỉ mang từ 4 đến 6 nốt. Tiến hành khử trùng ở nồng độ javel 1:5 trong 25 phút và cấy vào mơi trường thí nghiệm.
Quan sát mẫu sau 10 tuần nuơi cấy, ghi nhận kết quả: số lượng chồi dinh dưỡng hình thành.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi dinh dưỡng
Tên mơi trường Nồng độ BA (mg/l) Số lượng chồi dinh dưỡng Tỉ lệ chồi dinh dưỡng hình thành (%) Tình trạng chồi MSI0 0 8,33 ± 2,08 16,7 f Xanh MSI1 1 15,00 ± 3,00 30,0 e Xanh MSI2 2 26,67 ± 1,53 53,3 d Xanh MSI3 3 38,00 ± 2,65 76,0 b Xanh MSI4 4 47,00 ± 2,00 94,0 a Xanh MSI5 5 46,00 ± 2,00 92,0 a Lá bị xoắn MSI6 6 33,67 ± 2,89 67,3 c Vàng
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức p=0,05. Sau 2 tuần nuơi cấy các mắt ngủ bắt đầu cĩ cảm ứng với mơi trường nuơi cấy, mắt ngủ hơi phình to và cĩ màu hồng của cọng phát hoa. Sau 10 tuần ghi nhận kết quả vì khi đĩ các chồi dinh dưỡng được hình thành và cĩ kích thước đủ lớn để dùng cho thí nghiệm tiếp theo.
Ở mơi trường khơng bổ sung chất ĐHSTTV ghi nhận số lượng chồi dinh dưỡng hình thành rất ít (16,7%), chồi hình thành khoẻ mạnh, lá dày.
Ở mơi trường cĩ bổ sung chất ĐHSTTV số lượng chồi dinh dưỡng hình thành tăng rõ rệt so với mơi trường khơng bổ sung chất ĐHSTTV. Số chồi dinh dưỡng hình thành cao nhất ở mơi trường bổ sung 4 mg/l BA (94%).
Việc tái sinh chồi từ phát hoa được nhiều nhà nghiên cứu thực hiện ( Sagawa và Niimoto,1960; Sagawa, 1961; Kotomori và Murashige, 1965; Scully,1996, Tse và cộng sự,1971; Intuwong và cộng sự, 1972; Reisinger và cộng sự, 1976; Arditti và cộng sự, 1977a,b; Tanaka và Sakanishi,1977) Valmayor, 1977; Fast, 1979; Johnson và cộng sự, 1982).Và các tác giả này đều thấy lợi ích chính của phương pháp này là khơng làm tổn thương cây mẹ. Tanaka và Sakanishi (1978) đã sử dụng phát hoa cây P. amabilis lai nuơi cấy trên mơi trường Vacin-Went cĩ bổ sung BA 2,5 ppm. Họ nhận thấy khi các phát hoa được nuơi cấy ở 28oC, các nốt ở vị trí 3 và 4 cho tỉ lệ tái sinh chồi tốt nhất, và nhiệt độ nuơi cấy từ 28-30 oC là một yếu tố quan trọng để gỡ sự ngủ của chồi bên. Trong thí nghiệm này chúng tơi tiến hành nuơi cấy phát hoa dựa theo phương pháp của Tanaka và Sakanishi với điều kiện phịng nuơi cấy được duy trì ở nhiệt độ 27-28 oC và nồng độ BA sử dụng thay đổi từ 0 đến 6 mg/l. Kết quả cho thấy ở nồng độ BA 3 và 4 mg/l cho tỉ lệ chồi tái sinh rất cao (76 % và 94 %), các chồi tạo thành phát triển bình thường, khỏe .
Ernst (1984) cũng nghiên cứu sự tái sinh chồi từ phát hoa và cho thấy khi nồng độ Cytokinin trong mơi trường tăng lên (BAP từ 25 đến 125 ppm ) sẽ cảm ứng tạo cụm chồi và hình thành cây con từ nốt phát hoa, trong thí nghiệm này chúng tơi nhận thấy nếu tăng nồng độ BA lên 5 và 6 mg/l thì số lượng chồi dinh dưỡng hình thành giảm do: chồi hình thành nhưng phát hoa vàng và chết làm cho chồi dinh dưỡng chết theo hay làm mắt ngủ lẫn cọng phát hoa đều chết. Chồi dinh dưỡng hình thành trong mơi trường cĩ nồng độ chất ĐHSTTV cao sẽ phát triển khơng bình thường (lá dúng ở 2 bên mép, lá dài khơng ở dạng hình oval).
3.1.2 THÍ NGHIỆM 1.2: Thiết lập mơi trường và điều kiện thích hợp để khởi tạo và nhân PLB. nhân PLB.
* Xác định nồng độ hormon tối ưu cho sự biệt hĩa PLB từ mẫu lá của các chồi thu được trong thí nghiệm 1
Thí nghiệm này được tiến hành trên cả 5 giống, mỗi giống chọn lá cắt nhỏ cĩ kích thước 5 x 5 mm, mỗi nghiệm thức 30 mảnh lá, thí nghiệm được lập lại 3 lần
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHSTTV lên sự hình thành PLB từ lá
Theo Tanaka và Sakanishi (1980), việc nuơi cấy những mảnh lá chỉ thực hiện thành cơng với những mẫu lá non, cịn các lá trưởng thành khơng cĩ khả năng tạo PLB.Theo phương pháp này, PLB cĩ thể tạo ra khi nuơi cấy các mẫu lá in vitro được hình thành từ các chồi của phát hoa trên mơi trường MS, mỗi mẫu tạo ra trung bình khoảng 3,8 PLB tại mặt cắt của mẫu lá. Sự tạo PLB cịn phụ thuộc đoạn cắt của lá, thường những đoạn cuối lá cĩ khả năng tạo PLB cao hơn. Mơi trường thích hợp cho việc nuơi cấy là mơi trường MS cải tiến, Hyponex Japan (6,5-6-19), những giống thích hợp là Phalaenopsis hybrid.
So-young Park và cộng sự (2002) đã nghiên cứu vai trị của chất điều hịa sinh trưởng thực vật, nồng độđường và ảnh hưởng của ánh sáng đến việc cảm ứng tạo PLB
Mơi
trường Auxin cytokinin Loại
Tỉ lệ mẫu tạo PLB (%) GIỐNG 1 Tỉ lệ mẫu tạo PLB (%) GIỐNG 2 Tỉ lệ mẫu tạo PLB (%) GIỐNG 3 Tỉ lệ mẫu tạo PLB (%) GIỐNG 4 Tỉ lệ mẫu tạo PLB (%) GIỐNG 5 MSII1 NAA (1 mg/l) Adenine (10mg/l) 0 0 0 0 0 MSII2 NAA (1 mg/l) BA (10mg/l) 9,67±0,58 5,67±2,08 0,33±0,05 0,67±0,05 0 MSII3 NAA (1 mg/l) Adenine (10 mg/l) + BA (10mg/l) 30,0±1,0 15,67±3,06 2,33±0,58 2,67±0,58 0
NAA (5,4µM), sucrose 30 g/l cho số mẫu lá tạo PLB rất cao (85%) và trung bình tạo được khoảng 12 PLB trên một mẫu lá.
Trong thí nghiệm này chúng tơi chỉ khảo sát ảnh hưởng của BA ở nồng độ 10 mg/l kết hợp với NAA 1 mg/l và adenine 10 mg/l (Tanaka và Sakanishi, 1980) so sánh với việc sử dụng chỉ adenine hoặc chỉ BA kết hợp với NAA (bảng 3).
Sau 10 tuần nuơi cấy chỉ thu được kết quả từ giống số 1(Dtps Taida Salu) và giống số 2 (Dtps Taida Firebird) là 2 giống cĩ số lượng mẫu lá tạo PLB nhiều nhất, giống số 3 và 4 thì tạo PLB ít hơn hay những mảnh lá chỉ cĩ phản ứng với mơi trường