Mục đích: Theo dõi tỉ lệ sống sĩt và phát triển của các cây con cĩ nguồn gốc nuơi cấy trong bình Plantima và bình tam giác khi mang ra ngồi vườn ươm
Phương pháp: Các cây con cĩ bộ rễ khỏe mạnh thu được từ thí nghiệm ra rễ trên hệ thống Plantima và bình tam giác được lấy ra và rửa sạch, sau đĩ được trồng trong các vỉ nhựa với giá thể là dớn.
Trong tuần lễđầu phun sương nước cho cây con nhiều lần trong ngày để giữẩm cho cây, kết hợp phun B1 2 lần /tuần. Sau đĩ phun phân bĩn NPK 30-10-10 2 lần/ tuần. Theo dõi tỉ lệ sống và sự phát triển của cây con trong vườn ươm.
Các thí nghiệm thuộc nội dung 1 được thực hiện tại phịng thí nghiệm CNSH Thực vật trường Đại học Khoa học tự nhiên và tại Trung tâm Cơng nghệ sinh học
Các thí nghiệm thuộc nội dung 2,3,4,5,6 được thực hiện tại phịng thí nghiệm CNSH thực vật Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, Cây số 1900 Quốc lộ 1A, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12
Để đảm bảo điều kiện vơ trùng tương đối, các thí nghiệm trên hệ thống ngập chìm tạm thời được thực hiện trong một phịng nuơi riêng với điều kiện như sau:
Nhiệt độ : 25 ± 20C. Độẩm trung bình : 80 – 85%. Thời gian chiếu sáng : 12 giờ/ngày.
2.9 Xử lý số liệu
Số liệu trong các bảng được thống kê bằng chương trình Statistical Program Scientific System (SPSS) phiên bản 11.5 cho Windows. Sự khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức p=0.05 của các giá trị được biểu hiện bằng các mẫu tự khác nhau kèm theo sau số trung bình và sai số chuẩn.
PHẦN 3 KẾT QUẢ & THẢO LUẬN
3.1 NỘI DUNG 1: Thu thập mẫu thiết lập mơi trường và điều kiện thích hợp để vi nhân giống
3.1.1 Thí nghiệm 1.1: Thiết lập mơi trường tạo chồi in vitro từ các mắt ngủ của phát hoa. hoa.
* Xác định nồng độ chất khử trùng thích hợp cho việc tạo nguồn mẫu in vitro.
Sau 14 ngày nuơi cấy, ghi nhận kết quả những mẫu sạch khơng bị nhiễm khuẩn và nấm (mẫu cịn xanh khoẻ mạnh, khơng bị vàng, khơng bị hố đen, mắt ngủ vẫn cịn xanh khơng bị trắng do javel).
Bảng 3.1: Tỉ lệ % mẫu sống sau xử lý
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức p=0,05. Ở nồng độ javel 1:7 tỉ lệ nhiễm cao, điều này cho thấy nồng độ javel này quá thấp khơng đủđể diệt vi sinh vật.
Ở nồng độ javel 1:6 số lượng mẫu sạch tăng lên, do nồng độ javel cao hơn đã diệt được vi sinh vật. Tỉ lệ mẫu nhiễm khuẩn giảm hẳn chỉ cịn nhiễm do nấm là chủ yếu (vì ở nồng độ này vẫn chưa thích hợp để diệt được hồn tồn bào tử nấm).
Ở nồng độ javel 1:5 số mẫu sạch thu được cao nhất, ở nồng độ này javel đã đủ khả năng diệt hầu hết các vi sinh vật kể cả bào tử của nấm mốc.
Ở nồng độ javel 1:4 số mẫu sạch thu được cao hơn so với ở nồng độ javel 1:5, nhưng do nồng độ javel cao nên đã làm vàng và chết mẫu, cuối cùng tỉ lệ sống của mẫu giảm so với ở nồng độ 1:5.
Qua thí nghiệm trên chúng tơi rút ra kết luận là: ở nồng độ javel 1:5, mẫu được khử trùng trong 25 phút là điều kiện thích hợp để khử trùng mẫu. STT Nồng độ Javel Trung bình mmẫu ẫu sống/ 15 Tmỉ lẫệu s % sống ố Tình trạng mẫu 1 1:7 1,33 ± 0,58 8,9 ± 3,8 c Mẫu còn xanh 2 1:6 6,67 ± 1,53 44,5 ±10,2 b Mẫu còn xanh 3 1:5 14,00 ± 1,00 93,3 ± 6,7 a Mẫu còn xanh 4 1:4 7,67 ± 3,06 51.1 ± 20.3 b Mẫu bị vàng
* Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA lên sự hình thành chồi ở phát hoa
Chúng tơi khảo sát chung cả 5 giống lan Hồ Điệp trong thí nghiệm này mỗi nghiệm thức cĩ 50 mắt ngủ của đủ 5 giống.
Dùng nhánh phát hoa đã nở hồn tồn để cĩ đường kính lớn, chiều dày của lớp nhu mơ, số lượng của bĩ gỗ và bĩ libe nhiều. Sự hình thành nhiều bĩ mạch gĩp phần vận chuyển các chất dinh dưỡng và các chất đồng hố để nuơi mầm sau nầy. Hơn nữa, cây sau khi trổ hoa thì chúng ta biết được màu sắc, chất lượng hoa của cây mẹ một cách chính xác, đây là việc cần thiết khi nhân giống vơ tính (Võ Thị Bạch Mai, 1996).
Chọn những phát hoa to khỏe khơng bị thương tổn, cắt rời những mắt ngủ của cả 5 giống cho đủ số lượng, phần phát hoa sử dụng chỉ mang từ 4 đến 6 nốt. Tiến hành khử trùng ở nồng độ javel 1:5 trong 25 phút và cấy vào mơi trường thí nghiệm.
Quan sát mẫu sau 10 tuần nuơi cấy, ghi nhận kết quả: số lượng chồi dinh dưỡng hình thành.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi dinh dưỡng
Tên mơi trường Nồng độ BA (mg/l) Số lượng chồi dinh dưỡng Tỉ lệ chồi dinh dưỡng hình thành (%) Tình trạng chồi MSI0 0 8,33 ± 2,08 16,7 f Xanh MSI1 1 15,00 ± 3,00 30,0 e Xanh MSI2 2 26,67 ± 1,53 53,3 d Xanh MSI3 3 38,00 ± 2,65 76,0 b Xanh MSI4 4 47,00 ± 2,00 94,0 a Xanh MSI5 5 46,00 ± 2,00 92,0 a Lá bị xoắn MSI6 6 33,67 ± 2,89 67,3 c Vàng
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức p=0,05. Sau 2 tuần nuơi cấy các mắt ngủ bắt đầu cĩ cảm ứng với mơi trường nuơi cấy, mắt ngủ hơi phình to và cĩ màu hồng của cọng phát hoa. Sau 10 tuần ghi nhận kết quả vì khi đĩ các chồi dinh dưỡng được hình thành và cĩ kích thước đủ lớn để dùng cho thí nghiệm tiếp theo.
Ở mơi trường khơng bổ sung chất ĐHSTTV ghi nhận số lượng chồi dinh dưỡng hình thành rất ít (16,7%), chồi hình thành khoẻ mạnh, lá dày.
Ở mơi trường cĩ bổ sung chất ĐHSTTV số lượng chồi dinh dưỡng hình thành tăng rõ rệt so với mơi trường khơng bổ sung chất ĐHSTTV. Số chồi dinh dưỡng hình thành cao nhất ở mơi trường bổ sung 4 mg/l BA (94%).
Việc tái sinh chồi từ phát hoa được nhiều nhà nghiên cứu thực hiện ( Sagawa và Niimoto,1960; Sagawa, 1961; Kotomori và Murashige, 1965; Scully,1996, Tse và cộng sự,1971; Intuwong và cộng sự, 1972; Reisinger và cộng sự, 1976; Arditti và cộng sự, 1977a,b; Tanaka và Sakanishi,1977) Valmayor, 1977; Fast, 1979; Johnson và cộng sự, 1982).Và các tác giả này đều thấy lợi ích chính của phương pháp này là khơng làm tổn thương cây mẹ. Tanaka và Sakanishi (1978) đã sử dụng phát hoa cây P. amabilis lai nuơi cấy trên mơi trường Vacin-Went cĩ bổ sung BA 2,5 ppm. Họ nhận thấy khi các phát hoa được nuơi cấy ở 28oC, các nốt ở vị trí 3 và 4 cho tỉ lệ tái sinh chồi tốt nhất, và nhiệt độ nuơi cấy từ 28-30 oC là một yếu tố quan trọng để gỡ sự ngủ của chồi bên. Trong thí nghiệm này chúng tơi tiến hành nuơi cấy phát hoa dựa theo phương pháp của Tanaka và Sakanishi với điều kiện phịng nuơi cấy được duy trì ở nhiệt độ 27-28 oC và nồng độ BA sử dụng thay đổi từ 0 đến 6 mg/l. Kết quả cho thấy ở nồng độ BA 3 và 4 mg/l cho tỉ lệ chồi tái sinh rất cao (76 % và 94 %), các chồi tạo thành phát triển bình thường, khỏe . (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ernst (1984) cũng nghiên cứu sự tái sinh chồi từ phát hoa và cho thấy khi nồng độ Cytokinin trong mơi trường tăng lên (BAP từ 25 đến 125 ppm ) sẽ cảm ứng tạo cụm chồi và hình thành cây con từ nốt phát hoa, trong thí nghiệm này chúng tơi nhận thấy nếu tăng nồng độ BA lên 5 và 6 mg/l thì số lượng chồi dinh dưỡng hình thành giảm do: chồi hình thành nhưng phát hoa vàng và chết làm cho chồi dinh dưỡng chết theo hay làm mắt ngủ lẫn cọng phát hoa đều chết. Chồi dinh dưỡng hình thành trong mơi trường cĩ nồng độ chất ĐHSTTV cao sẽ phát triển khơng bình thường (lá dúng ở 2 bên mép, lá dài khơng ở dạng hình oval).
3.1.2 THÍ NGHIỆM 1.2: Thiết lập mơi trường và điều kiện thích hợp để khởi tạo và nhân PLB. nhân PLB.
* Xác định nồng độ hormon tối ưu cho sự biệt hĩa PLB từ mẫu lá của các chồi thu được trong thí nghiệm 1
Thí nghiệm này được tiến hành trên cả 5 giống, mỗi giống chọn lá cắt nhỏ cĩ kích thước 5 x 5 mm, mỗi nghiệm thức 30 mảnh lá, thí nghiệm được lập lại 3 lần
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHSTTV lên sự hình thành PLB từ lá
Theo Tanaka và Sakanishi (1980), việc nuơi cấy những mảnh lá chỉ thực hiện thành cơng với những mẫu lá non, cịn các lá trưởng thành khơng cĩ khả năng tạo PLB.Theo phương pháp này, PLB cĩ thể tạo ra khi nuơi cấy các mẫu lá in vitro được hình thành từ các chồi của phát hoa trên mơi trường MS, mỗi mẫu tạo ra trung bình khoảng 3,8 PLB tại mặt cắt của mẫu lá. Sự tạo PLB cịn phụ thuộc đoạn cắt của lá, thường những đoạn cuối lá cĩ khả năng tạo PLB cao hơn. Mơi trường thích hợp cho việc nuơi cấy là mơi trường MS cải tiến, Hyponex Japan (6,5-6-19), những giống thích hợp là Phalaenopsis hybrid.
So-young Park và cộng sự (2002) đã nghiên cứu vai trị của chất điều hịa sinh trưởng thực vật, nồng độđường và ảnh hưởng của ánh sáng đến việc cảm ứng tạo PLB
Mơi
trường Auxin cytokinin Loại
Tỉ lệ mẫu tạo PLB (%) GIỐNG 1 Tỉ lệ mẫu tạo PLB (%) GIỐNG 2 Tỉ lệ mẫu tạo PLB (%) GIỐNG 3 Tỉ lệ mẫu tạo PLB (%) GIỐNG 4 Tỉ lệ mẫu tạo PLB (%) GIỐNG 5 MSII1 NAA (1 mg/l) Adenine (10mg/l) 0 0 0 0 0 MSII2 NAA (1 mg/l) BA (10mg/l) 9,67±0,58 5,67±2,08 0,33±0,05 0,67±0,05 0 MSII3 NAA (1 mg/l) Adenine (10 mg/l) + BA (10mg/l) 30,0±1,0 15,67±3,06 2,33±0,58 2,67±0,58 0
NAA (5,4µM), sucrose 30 g/l cho số mẫu lá tạo PLB rất cao (85%) và trung bình tạo được khoảng 12 PLB trên một mẫu lá.
Trong thí nghiệm này chúng tơi chỉ khảo sát ảnh hưởng của BA ở nồng độ 10 mg/l kết hợp với NAA 1 mg/l và adenine 10 mg/l (Tanaka và Sakanishi, 1980) so sánh với việc sử dụng chỉ adenine hoặc chỉ BA kết hợp với NAA (bảng 3).
Sau 10 tuần nuơi cấy chỉ thu được kết quả từ giống số 1(Dtps Taida Salu) và giống số 2 (Dtps Taida Firebird) là 2 giống cĩ số lượng mẫu lá tạo PLB nhiều nhất, giống số 3 và 4 thì tạo PLB ít hơn hay những mảnh lá chỉ cĩ phản ứng với mơi trường (lá vênh lên, cĩ những đốm trắng ở rìa mép mà khơng tạo được PLB), cịn ở giống thứ 5 (Mãn Thiên Hồng) lá hố đen và chết sau 2 tuần nuơi cấy.
Các PLB được hình thành chủ yếu từ các mảnh lá ở phần gốc và ít ở các mảnh lá phần đỉnh. Lá và thân mặc dù cĩ những nét giống nhau về hình thái giải phẫu nhưng khác nhau về cách sinh trưởng và cách sắp xếp các mơ. Lá cĩ sinh trưởng tận cùng hữu hạn. Do đĩ, để cĩ sự phát sinh hình thái mới, đỉnh lá cũng cần phải cĩ sự phân hố của các tế bào nhu mơ để trở về trạng thái mơ phân sinh.
Sau một thời gian, các chồi xuất hiện xung quanh mép lá (nơi cĩ vết thương) tiếp tục phát triển trong khi phần mơ lá ban đầu bị hoại đi. Phiến lá ban đầu được sử dụng như nguồn dinh dưỡng khởi đầu cho PLB và cho chồi sau này nhưng hệ thống mạch của chồi được hình thành thì hồn tồn độc lập với hệ thống mạch của mơ mẹ. Mơi trường cĩ bổ sung 10 mg/l BA thì cĩ PLB hình thành. Tuy nhiên tỉ lệ hình thành PLB trên mỗi mẫu ở mơi trường này rất ít.
Trong mơi trường nếu chỉ cĩ adenine thì hồn tồn khơng cĩ PLB hình thành. Nhưng trong mơi trường cĩ sự hiện diện của cả hai 2 loại cytokinin thì sự tạo PLB là nhiều nhất. Ðiều này cĩ thể giải thích là: do adenine là tiền chất của hormone thực vật do đĩ khơng đủ khả năng để kích thích mơ lá biệt hố thành PLB, khi cĩ sự hiện diện của BA trong mơi trường thì PLB được hình thành và khi đã cĩ sự hình thành PLB thì adenine cĩ tác dụng để tăng sinh PLB .
* Xác định nồng độ hormon tối ưu để nhân nhanh PLB.
Ở 2 giống (Dtps. Taida Salu, giống số 1; Dtps. Taida Firebird, giống số 2) số lượng PLB tạo ra nhiều nhất nên chúng tơi sử dụng PLB của 2 giống này để thực hiện thí nghiệm.
Mỗi nghiệm thức được nuơi cấy với 3 bình, mỗi bình chứa 10 PLB. PLB được lựa chọn đồng cỡ đều nhau và chưa hình thành chồi, được cắt ngang làm đơi và nuơi cấy trong mơi trường MS 1/2 cĩ bổ sung BA và NAA ở những nồng độ khác nhau, 30 g/l đường sucrose, 15% nước dừa, 1g/l than hoạt tính, 8 g/l agar, pH = 5,8
Sau 8 tuần nuơi cấy ghi nhận kết quả số lượng PLB tạo thành
Bảng 3.4 : Ảnh hưởng của chất điều hồ sinh trưởng thực vật lên sự nhân nhanh PLB từ một PLB ban đầu Mơi trường NAA-BA (mg/l) PLB tạo thành Giống 1 Tình trạng PLB Giống 1 PLB tạo thành Giống 2 Tình trạng PLB Giống 2 NB1 0,5-1 0,77±0,19 f Rất ít 1,11±0,38 e Ít NB2 0,5-2 4,22±0,51 d Nhỏ, vàng 3,33±0,58 d Vàng xanh NB3 1-1 6,77±0,51 c Nhỏ, vàng 5,44±0,38 c xanh NB4 1-2 8,56±0,19 b Lớn, vàng xanh 7,22±0,19 b xanh
NB5 1-3 13,89±0,96 a Lớn, vàng xanh 11,5±0,38a xanh
NB6 1-4 8,33±0,67 b Nhiều chồi, xanh 3,88±0,84 d Chồi hình thành
NB7 2-1 1,77±0,19 e Nhiều chồi 1,11±0,51 e thành, cĩ rễ Chồi hình Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức p=0,05.
Các PLB bị cắt làm đơi tiết rất nhiều phenol nên dễ làm đen mẫu và gây chết mẫu, do đĩ khi cắt phải chọn lựa những PLB đủ lớn, dùng dao bén để khơng làm dập mẫu. Dùng acid citric vơ trùng để rửa mẫu cắt, làm giảm lượng phenol trên mẫu do vết thương tiết ra.
Ở nghiệm thức NB1 (MS1/2 + 0,5mg/l NAA + 1mg/l BA )PLB hình thành rất ít do lượng chất ĐHSTTV chưa đủđể kích thích hình thành PLB ở mẫu bị cắt.
Khi tăng lượng chất ĐHSTTV thì thấy lượng PLB tạo thành và tăng dần khi tăng lượng chất ĐHSTTV. Ở nghiệm thức NB5 (MS1/2 + 1mg/l NAA + 3mg/l BA) cho thấy PLB phát triển tốt ở cả 2 giống (kích thước to cĩ màu xanh nhạt hơi vàng).
Ở nghiệm thức NB7 (MS1/2 + 2mg/l NAA + 1mg/l BA) khi tăng lượng NAA lên thì thấy ở PLB cĩ sự hình thành rễ và lượng PLB giảm hẳn, và chồi xuất hiện. Điều này là do Auxin ở nồng độ thấp (phối hợp với cytokinin) giúp tăng trưởng chồi non và khởi tạo mới mơ phân sinh ngọn chồi từ nhu mơ, Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ và cả sự tăng trưởng của rễ này (Bùi Trang Việt, 2000)
* Khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLB
Để xác định loại đường thích hợp cho sự nhân nhanh PLB của 2 giống số 1 và số 2, chúng tơi khảo sát ảnh hưởng của 2 loại đường glucose và sucrose lên sự nhân nhanh PLB trên mơi trường MS 1/2 bổ sung BA 3 mg/l và NAA 1 mg/l, 2 loại đường sucrose và glucose ở các nồng độ khác nhau tùy theo nghiệm thức. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của 2 loại đường lên sự nhân PLB
Mơi trường Sucrose - Glucose (g/l) Số lượng PLB tạo thành của giống 1 Tình trạng PLB giống 1 Số lượng PLB tạo thành của giống 2 Tình trạng PLB giống 2 SG1 30 – 0 13,11±0,38c Chồi 12,00±0,58c Xanh SG2 25 – 5 13,66±0,33c Chồi 12,56±0,38c Xanh SG3 20 – 10 15,44±0,19b ít chồi 13,88±0,51b Xanh
SG4 15 – 15 16,88±0,51a Cĩ nhilơng hút ều 15,44±1,02a Xanh
SG5 10 – 20 13,44±0,19c Vàng 11,55±2,91c Xanh
SG6 5 – 25 5,88±0,84d Vàng 6,80±2,2d Xanh
Nghiên cứu của Tokuhara và Masahiro (2003) đã chứng minh ảnh hưởng rất đáng kể của các nguồn carbohydrate khác nhau lên sự hình thành PLB từ huyền phù tế bào của cây lan Hồ Điệp Doritaenopsis New Toyohashi. Trong nghiên cứu này cho thấy nồng độ đường Glucose 58,4 mM cho sự hình thành PLB nhiều nhất sau 8 tuần nuơi cấy. Trong khi đĩ trong mơi trường chứa maltose cĩ xuất hiện PLB sau 1 tháng nuơi cấy, tuy nhiên lượng PLB rất ít chỉ bằng 8% lượng PLB thu được trên mơi trường chứa Glucose. Trường hợp mơi trường chứa sorbitol cũng tạo được một ít PLB và callus sau 8 tuần nuơi cấy. Khi nuơi cấy lượng huyền phù tế bào của cây Doritaenopsis