phát hoa.
Mục đích: -Xác định nồng độ chất khử trùng thích hợp cho việc tạo nguồn mẫu in vitro.
- Xác định nồng độ hormon tối ưu cho sự biệt hĩa thành chồi dinh dưỡng từ chồi ngủ phát hoa
Vật liệu: - Phát hoa của 5 giống lan Hồ Ðiệp được thu khi hoa đã nở hết trên cành. Chọn những phát hoa to khoẻ, cắt những đốt chứa mắt ngủ dài 4cm, tách bỏ vỏ bao quanh mắt ngủ (nhẹ nhàng, khơng làm tổn thương mắt ngủ). Tình trạng mắt ngủ phải cịn trắng xanh hay hơi đỏ của màu phát hoa, loại bỏ những mắt ngủ bị hố đen và bị trày sướt. Tiến hành khử trùng mẫu chọn thời gian và nồng độ chất khử trùng thích hợp cho tỉ lệ mẫu sống và vơ trùng cao nhất
Phương pháp:
-Tiến hành khử trùng: Lau nhẹ mắt ngủ bằng cồn 70o và cho vào erlen sạch. Sau đĩ tiến hành lắc với xà phịng lỗng trong 3 phút và rửa lại bằng nước cất để loại bỏ hết xà phịng, dùng giấy nhơm bịt kín miệng erlen và cho vào tủ cấy.
Mẫu được khử trùng với cồn 70o trong 1 phút, sau đĩ được khử trùng với dung dịch javel cĩ nồng độ khác nhau (trong 100ml dung dịch javel cĩ bổ sung 2 giọt Tween 20, và lắc đều). Sau khi khử trùng được 25 phút tiến hành rửa lại mẫu bằng nước cất vơ trùng (3 lần) để loại bỏ hết javel và Tween 20.
-Tiến hành cấy mẫu: cắt bỏ những phần mẫu bị javel làm tổn thương (trắng) ở 2 đầu, sau đĩ cấy mẫu vào mơi trường MS. Mẫu nuơi cấy được đặt trong điều kiện: 25oC, 12 giờ chiếu sáng và ẩm độ là 80%.
Mỗi nghiệm thức cĩ 15 mắt ngủ, thí nghiệm được tiến hành lập lại 3 lần, quan sát và ghi nhận kết quả sau 2 tuần khử trùng.
* Để xác định nồng độ hormon tối ưu cho sự biệt hĩa thành chồi dinh dưỡng từ chồi ngủ phát hoa, các chồi ngủ được nuơi cấy trong các ống nghiệm chứa mơi trường MS cĩ bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau (từ 0-6 mg/l). Mỗi nghiệm thức sử dụng 50 mắt ngủ. Quan sát mẫu sau 10 tuần nuơi cấy. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Nồng độ chất khử trùng và thời gian khử trùng thích hợp
- Số lượng chồi dinh dưỡng hình thành trên mơi trường thích hợp
2.1.2 Thí nghiệm 1.2: Thiết lập mơi trường và điều kiện thích hợp để khởi tạo và nhân PLB.
Mục đích : -Xác định nồng độ hormon tối ưu cho sự biệt hĩa PLB từ mẫu lá của các chồi thu được trong thí nghiệm 1
- Xác định nồng độ hormon tối ưu để nhân nhanh PLB. - Khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLB .
Phương pháp thí nghiệm :
* Để xác định nồng độ hormon tối ưu cho sự biệt hĩa PLB từ mẫu lá: Thí nghiệm này được tiến hành trên cả 5 giống, mỗi giống chọn lá cắt nhỏ khoảng 100 mảnh, mỗi mảnh cĩ kích thước 5 x 5 mm. Các mẫu lá được đặt nuơi trên mơi trường MS 1/2 bổ sung các chất điều hồ sinh trưởng thực vật NAA, BA, Adenin theo bảng sau:
Bảng 2.1: Các mơi trường khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHSTTV lên sự hình thành PLB từ lá
Mơi trường Nồng độ NAA (mg) Nồng độ adenine (mg/l) Nồng độ BA (mg/l)
MSII1 1 10 0
MSII2 1 0 10
MSII3 1 10 10
sucrose (30 g/l), nước dừa 15%, than hoạt tính 1g/l, Agar 8g/l. Thí nghiệm được lập lại 3 lần, mỗi lần 3 bình, mật độ mẫu cấy là 10 mẫu/bình. Nghiệm thức được bố trí như sau:
Bảng 2.2: Các mơi trường khảo sát ảnh hưởng của chất điều hịa sinh trưởng lên sự nhân PLB
Chất điều hịa sinh trưởng (mg/l)
Ký hiệu
mơi trường NAA BA
NB1 0,5 1 NB2 0,5 2 NB3 1 1 NB4 1 2 NB5 1 3 NB6 1 4 NB7 2 1
* Để khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLB: Từ kết quả thí nghiệm trên chọn ra tỉ lệ BA và NAA thích hợp nhất tiếp tục thí nghiệm trên những nồng độđường khác nhau với vật liệu là PLB của 2 giống số 1 và số 2 theo bảng sau:
Bảng 2.3: Các mơi trường khảo sát ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường sử dụng lên sự nhân PLB.
Ký hiệu mơi trường Sucrose (g/l) Glucose (g/l)
SGI 30 0 SGII 25 5 SGIII 20 10 SGIV 15 15 SGV 10 20 SGVI 5 25 SGVII 0 30
Từ kết quả ở thí nghiệm này ta chọn mơi trường thích hợp nhất để sử dụng cho tất cả thí nghiệm nhân PLB về sau.
Chỉ tiêu theo dõi :
-Tỉ lệ mẫu lá hình thành PLB của 5 giống HồĐiệp lai sau 8 tuần nuơi cấy.
- Số lượng PLB tạo thành của 2 giống Hồ điệp lai (Dtps. Taida Salu, giống số 1;
Dtps. Taida Firebird, giống số 2) sau 8 tuần nuơi cấy trên các mơi trường cĩ bổ sung chất điều hịa sinh trưởng cũng như trên các mơi trường cĩ 2 loại đường ở các nồng độ khác nhau.
2.1.3 Thí nghiệm 1.3: Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLB.
Mục đích : Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLB
Vật liệu : Các PLB của 2 giống HồĐiệp lai (Dtps. Taida Salu, giống số 1; Dtps. Taida Firebird, giống số 2) thu được trong thí nghiệm 2
Phương pháp thí nghiệm :
Các PLB được đặt nuơi cấy trên mơi trường dinh dưỡng MS1/2 cĩ bổ sung: Peptone (2 g/l), CW (15%), PVP (500 mg/l), sucrose (20 g/l), khoai tây (30 g/l), agar (8 g/l), than hoạt tính (CA) (1 g/l), pH 5,8. Tùy theo nghiệm thức thí nghiệm cĩ bổ sung BA 0; 0,5 và 1 mg/l
Thí nghiệm được lập lại 3 lần, mỗi lần 5 bình, mỗi bình chứa 10 PLB.
Chỉ tiêu theo dõi : Tỉ lệ PLB phát triển thành chồi.
2.1.4 Thí nghiệm 1.4: Tìm mơi trường thích hợp cho sự ra rễ
Mục đích : Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ của chồi HồĐiệp.
Phương pháp thí nghiệm: Các chồi tái sinh từ PLB được đặt nuơi cấy trên mơi trường MS bổ sung NAA ở nồng độ khác nhau (0 ;0,5 ;1 mg/l).
Chỉ tiêu theo dõi:
- Số lượng rễ hình thành - Chiều dài rễ