L ỜI CẢM ƠN
5.2.Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy của
5. Xác định đặc điểm hình thái và đặc điểm nuôi cấy của nấm men, vi khuẩn
5.2.Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy của
của vi khuẩn acetic có số lượng chủ yếu phân lập được từ quá trình lên men ca
cao tự nhiên ở mẫu 10, mẫu 11, mẫu 12
Có sự khác biệt về số nhóm vi khuẩn acetic xuất hiện trong 3 mẫu 10, 11, 12. Trong đó mẫu 12 là mẫu có số nhóm vi khuẩn acetic xuất hiện lớn nhất (4 nhóm), sau đó đến mẫu 10 (3 nhóm) và cuối cùng là mẫu 11 (2 nhóm).
Ở mẫu 10, có 3 nhóm vi khuẩn acetic chủ yếu được kí hiệu là LA10.1,
LA10.2, LA10.3, trong đó nhóm LA10.1 có số lượng lớn nhất vì vậy chúng được định danh sơ bộ và lưu giữ mẫu.
Có 2 nhóm vi khuẩn acetic được tìm thấy trong mẫu 11, chúng được kí hiệu là LA11.1, và LA11.2, trong đó nhóm LA11.2 chiếm số lượng chủ yếu nhất.
Mẫu 12 là mẫu có số nhóm vi khuẩn acetic xuất hiện nhiều nhất trong 3 mẫu, chúng được kí hiệu là LA12.1, LA12.2, LA12.3, và LA 12.4, trong đó chủng
LA12.1 có số lượng lớn nhất.
Tiến hành định danh sơ bộ vi khuẩn acetic bằng một số phương pháp như quan sát đặc điểm hình dạng khuẩn lạc và đặc điểm hình thái tế bào bằng phương
pháp nhuộm gram, và xác định hàm lượng acid được sinh ra bằng phương pháp đo đường kính vòng trong. Đặc điểm các chủng nghiên cứu được trình bày trong Bảng
3.2, Hình 3.16.
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái, và đặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn
acetic có số lượng chủ yếu phân lập được trong 3 mẫu ca cao lên men tự nhiên
Mô tả Đặc điểm
LA10.1 LA11.2 LA12.1
Hình dạng
khuẩn lạc
Hình tròn, bề măt bóng, nhân lồi,
bên ngoài nhân có một vòng tròn lõm xuống.
Hình tròn, bề măt
nhẵn bóng, nhân ở
giữa lồi lên và sẫm
màu Hình tròn, bề măt nhẵn bóng, nhân sẫm màu Hình thái tế bào Hình tròn Hình que, rất ngắn Que, rất ngắn Khả năng sinh acid Đường kính khuẩn lạc : 0,45 cm. Đường kính vòng trong: 1,0 cm. Đường kính khuẩn lạc : 0,35 cm Đường kính vòng trong: 1,1 cm. Đường kính khuẩn lạc : 0,4 cm Đường kính vòng trong: 1,8 cm.
Hình dạng khuẩn lạc LA10.1 Hình thái tế bào LA10.1
Hình dạng khuẩn lạc LA11.2 Hình thái tế bào LA11.2
Hình dạng khuẩn lạc LA12.1 Hình thái tế bào LA12.1
Hình 3.16. Hình thái dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào của LA1
Qua bảng 3.2 cho thấy chúng có hình dạng khuẩn lạc, hình thái tế bào và khả năng sinh acid khác nhau, trong đó nhóm LA12.1 có khả năng sinh acid lớn
nhất với đường kính vòng trong 1,8 cm, sau đó đến LA11.2, và cuối cùng là LA10.1.
5.3. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy
của vi khuẩn lactic có số lượng chủ yếu phân lập được từ quá trình lên men ca (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
cao tự nhiên ở mẫu 10, mẫu 11, mẫu 12.
Số nhóm vi khuẩn lactic xuất hiện trong quá trình lên men tự nhiên hạt ca
cao là tương đối ít. Mẫu có số nhóm vi khuẩn lactic xuất hiện nhiều nhất là mẫu 10
với 3 nhóm, 2 mẫu 11 và 12 có 2 nhóm vi khuẩn lactic xuất hiện.
Ở mẫu 10 có 3 nhóm vi khuẩn lactic chủ yếu được kí hiệu LL10.1, LL10.2, LL10.3, trong đó nhóm LL10.3 có số lượng chủ yếu nhất. Ở mẫu 11, có 2 nhóm vi
khuẩn lactic xuất hiện, chúng được kí hiệu là LL11.1, LL11.2, với nhóm LL11.2
chiếm số lượng chủ yếu. Ở mẫu 12 cũng chỉ xuất hiện có 2 nhóm vi khuẩn lactic,
với nhóm LL12.1 chiếm số lượng chủ yếu.
Đặc điểm hình dạng khuẩn lạc, hình thái tế bào và đặc tính sinh hóa của chúng được trình bày trong bảng 3.3, hình 3.17.
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái, và đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn lactic Mô tả Đặc điểm LL10.3 LL11.2 LL12.1 Hình dạng khuẩn lạc Hình tròn, bề mặt nhẵn bóng, màu nâu. Hình tròn, bề mặt nhẵn, có nhân nổi
lên trên, màu nâu nhẹ
Hình hoa, bề mặt
nhám
Hình thái tế bào que, dài que, dài que, dài
Nhuộm Gram + + +
Phản ứng
catalaza
Hình dạng khuẩn lạc LL10.3 Hình thái tế bào LL10.3
Hình dạng khuẩn lạc LL11.2 Hình thái tế bào LL11.2
Hình dạng khuẩn lạc LL12.1 Hình thái tế bào LL12.1
Hình 3.17. Hình thái tế bào của vi khuẩn lactic
Kết quả nghiên cứu cho thấy các nhóm vi khuẩn lactic đều là Gram (+),
Nhóm LL12.1 có hình hoa, bề mặt nhám trong khi nhóm LL11.2 và LL10.3 lại có
hình tròn, và bề mặt nhẵn.
5.4. Kết quả giải trình tự gen của các chủng vi sinh có số lượng chủ yếu phân lập được trong quá trình lên men ca cao tự nhiên ở mẫu 12.
Trong 3 mẫu nghiên cứu được trình bày ở trên thì mẫu 12 là mẫu có chất lượng cao nhất sau đó đến mẫu 11 và mẫu 10, tuy nhiên có một số trái ngược giữa
số lượng vi sinh vật với chất lượng hạt ca cao thương phẩm.
Số lượng tế bào nấm men của mẫu 11 là cao nhất sau đó đến mẫu 12 và cuối
cùng là mẫu 10.
Số lượng tế bào vi khuẩn acetic và lactic lại có sự trùng hợp với chất lượng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hạt ca cao sau lên men, số lượng vi khuẩn acetic và vi khuẩn lactic của mẫu 12 là cao nhất sau đó là mẫu 11 và cuối cùng là mẫu 10.
Vì mẫu 12 là mẫu có chất lượng tốt nhất trong 12 mẫu lên men, do đó các
chủng vi sinh có số lượng chủ yếu trong mẫu nghiên cứu này ngoài việc định danh sơ bộ còn được định danh bằng phương pháp xác định gen với hy vọng các chủng
nấm men, vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic ở mẫu này sẽ có tác động tốt đến chất lượng hạt ca cao sau lên men. Kết quả giải trình tự gen được trình bày bên dưới.
5.4.1. Nấm men
Sau khi định danh sơ bộ, tiến hành định danh NM12.1, NM12.2 bằng phương pháp giải trình tự gen 28S và tra cứu trên BLAST SEARCH, kết quả thu được được thể hiện bên dưới.
Hình 3.18. Kết quả giải trình tự gen 28S của LN96hN2 (thuộc nhóm NM12.1)
Hình 3.19. Kết quả giải trình tự gen 28S của LN120hN1 (thuộc nhóm NM12.2)
Kết quả giải trình tự gen cho thấy chủng nấm men LN96hN2 (thuộc nhóm
Saccharomyces sp.. Dưới đây là đồ thị biễu diễn sự biến đổi số lượng của 2 chủng
nấm men được định danh ở trên trong mẫu 12.
Hình 3.20. Đồ thị biểu diễn sự biến đổi số lượng của các chủng nấm men
trong suốt quá trình lên men
Đồ thị biểu diễn ở hình 3.18 cho thấy:
Saccharomyces sp. có mặt sau 48 h lên men. Trong giai đoạn đầu, số lượng
của Saccharomyces sp.thấp hơn Pichia sp.. Tuy nhiên sau 96 h lên men,
Saccharomyces sp. tăng đột biến, đạt cao nhất với số lượng là 8,69 lg (CFU / g) và
cao hơn Pichia sp.( 8,6 lg (CFU / g)). Sau 96 h số lượng của cả 2 chủng này giảm đột ngột và tiếp tục giảm cho đến cuối quá trình lên men. Saccharomyces sp. và
Pichia sp. trong nghiên cứu này tương đồng 100% với S.cerevisiae và Pichia kudriavzevii.
Trong khi đó, theo nghiên cứu của L. Jespersen và cộng sự, S.cerevisiae có số lượng chủ yếu ở giai đoạn 0-48 h, và đạt cao nhất (chiếm 90%) trong tất cả các
nhóm có mặt trong quá trình lên men tự nhiên ca cao sau 48 h lên men. Ở 72 h lên men, số lượng của S.cerevisiae giảm [9].
Trong nghiên cứu của Ardhana & Fleet tại Indonesia S.cerevisiae là một
trong những chủng có số lượng chủ yếu và tồn tại trong suốt quá trình lên men ở cả 3 vùng phía đông Java, Indonesia được nghiên cứu, trong nghiên cứu này có đề cập
S.cerevisiae có thể phát triển ở nhiệt độ trên 40 0 C và là loài có khả năng phát triển
tốt khi môi trường có chứa 7 % ethanol [17].
Bên cạnh sự khác biệt so với một số nghiên cứu ở nước ngoài được nêu ở
trên thì trong một nghiên cứu trong nước của Trần Xuân Ngạch và cộng sự (2002)
các chủng nấm men phân lập được từ quá trình lên men tự nhiên ca cao ở Quảng
Ngãi là Hansenia spora uvarum, Galactomyces reessii, Candida Sorboxylosa, Candida fructus, trong số các chủng nấm men thu được trong nghiên cứu trên không có mặt của S.cerevisiae và Pichia kudriavzevii. [4]
Điều này cho thấy sự có mặt, số lượng, giai đoạn phát triển của các chủng vi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
sinh ở các nghiên cứu hoàn toàn khác nhau, sự khác biệt này có thể là do nguyên liệu ở mỗi vùng lên men là khác nhau, độ ẩm của khối lên men, hàm lượng chất dinh dưỡng có trong nguyên liệu lên men, mùa vụ thu hoạch, phương pháp lên men, điều kiện lên men, lượng hạt ca cao trong mỗi lần lên men, dụng cụ lên men,… khác nhau.
5.3.2 Vi khuẩn acetic
Sau khi định danh sơ bộ, tiến hành định danh LA12.1 bằng phương pháp giải
trình tự gen 16S và tra cứu trên BLAST SEARCH. Kết quả thu được được thể hiện bên dưới.
Hình 3.21. Kết quả giải trình tự gen 16S của LA-24 h N4 (thuộc nhóm LA12.1)
Kết quả giải trình tự gen cho thấy chủng LA-24 h N4 (thuộc nhóm LA12.1)
là Acetobacter sp., và số lượng của chúng biến đổi trong suốt quá trình lên men.
Hình 3.22. Sự biến đổi số lượng vi khuẩn acetic trong quá trình lên men.
Đồ thị cho thấy số lượng Acetobacter sp. biến động trong một khoảng rất lớn
trong suốt quá trình lên men. Vi khuẩn Acetobacter sp. xuất hiện sau 24 h lên men với số lượng 3,74 lg (CFU / g), sau đó số lượng chúng tăng dần và đạt cao nhất sau
96 h lên men với số lượng 7,2 lg (CFU / g). Sau 96 h lên men số lượng chúng giảm
dần. Ở thời điểm kết thúc quá trình lên men số lượng chúng còn 5,85 lg (CFU / g).
Acetobacter sp. trong nghiên cứu này tương đồng 100% với Acetobacter tropicalis .
Theo nghiên cứu của Nielsen Acetobacter tropicalis là chủng có số lượng
chủ yếu trong suốt quá trình lên men đống lớn (500 kg), sau 24 h lên men chúng chiếm 29% tổng số vi khuẩn acetic có mặt, về cuối quá trình lên men số lượng của
chúng gần như chiếm 100% so với các chủng có mặt. Tuy nhiên ở lên men đống
nhỏ (50 kg) thì chúng chỉ xuất hiện duy nhất sau 72 h lên men với 45% tổng số vi
khuẩn acetic có mặt [10].
Theo kết quả nghiên cứu của Camu và công sự (năm 2007) thì Acetobacter pasteurianus là loài vi khuẩn acetic chính tham gia trong quá trình lên men hạt ca
cao tự nhiên, Acetobacter syzygii, Acetobacter ghanensis, Acetobacter tropicalis, và
Acetobacter senegalensis chỉ là số ít [22], còn theo Nielsen và cộng sự (năm 2007),
Acetobacter syzygii, Acetobacter pasteurianus và Acetobacter tropicalis là vi khuẩn
acetic chiếm ưu thế trong quá trình lên men [24].
Ở nghiên cứu này với khối lượng mẫu nhỏ và lên men trong thùng xốp, vi
khuẩn Acetobacter tropicalis lại chiếm số lượng chủ yếu trong tất cả các nhóm có
xuyên suốt quá trình lên men. Ở giai đoạn cuối, số lượng của chúng giảm nhưng
vẫn chiếm ưu thế so với các chủng khác. Có sự khác biệt trên cũng là điều dễ hiểu vì có sự khác biệt về nguồn nguyên liệu, sự dao động trong điều kiện tiến hành lên
men và phương pháp lên men ở các vùng.
5.3.3. Vi khuẩn lactic
Sau khi định danh sơ bộ, tiến hành định danh LL12.1 bằng phương pháp giải (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trình tự gen 16S và tra cứu trên BLAST SEARCH. Kết quả thu được được thể hiện bên dưới.
Hình 3.23. Kết quả giải trình tự gen 16S của LL12.1
Kết quả giải trình tự gen cho thấy chủng LL12.1 là Lactobacillus sp.. Dưới đây là đồ thị biễu diễn sự biến đổi về số lượng của chúng trong suốt quá trình lên men.
Hình 3.24. Sự biến đổi số lượng vi khuẩn lactic Lactobacillus sp. (LL12.1)trong
Vi khuẩn lactic tham gia vào quá trình lên men khá muộn so với các nhóm vi
sinh vật khác [10] nhưng ở trong nghiên cứu này vi khuẩn lactic xuất hiện ngay từ đầu của quá trình lên men với số lượng khiêm tốn 2 lg (CFU / g).
Lactobacillus sp. xuất hiện sau 24 h lên men với số lượng 2 lg (CFU / g), sau đó số lượng chúng tăng dần và đạt 5,77 lg (CFU / g), và đạt cao nhất sau 120 h
lên men với số lượng là 7,633 lg (CFU / g), số lượng chúng giảm khi kết thúc quá
trình lên men (6,56 lg (CFU / g). Lactobacillus sp. trong nghiên cứu này tương đồng 100% với Lactobacillus fermentum.
Theo Camu và cộng sự, trong quá trình lên men tự nhiên hạt ca cao ở Ghana
thì Lactobacillus fermentum cũng là chủng vi khuẩn lactic chiếm số lượng chủ yếu
[21]. Không chỉ trong nghiên cứu của Camu và cộng sự mà trong nghiên cứu của
Nielsen và cộng sự về hệ vi sinh vật trong quá trình lên men ca cao ở Ghana chủng
Lactobacillus fermentum cũng là vi khuẩn lactic chủ yếu trong hầu hết các mẫu
[23]. Ngoài ra Roelofsen và Giesberger (1947) cũng tìm thấy Lb. fermentum chiếm
số lượng chủ yếu trong quá trình lên men ca cao ở Indonesia [10].
Lên men ca cao là một quá trình tương các của các nhóm vi sinh vật, chúng
tạo nên những biến đổi sinh lý sinh hóa trong suốt quá trình này, là nguyên nhân hình thành nên các hợp chất tiền sinh hương, những hợp chất này sẽ phát triển và tạo hương vị cho chocolate thông qua công đoạn rang và quá trình chế biến. Qua đó
cho thấy số lượng, cũng như chủng loại vi sinh tham gia vào quá trình lên men có một vai trò vô cùng quan trọng quyết định chất lượng hạt ca cao thương phẩm.
Bên cạnh yếu tố vi sinh thì các yếu tố khác cũng có ảnh hưởng rất lớn đến
chất lượng hạt ca cao sau lên men. Theo nghiên cứu của Camu và cộng sự đối với
lên men ở Ghana cho thấy kích thước của khối lên men, thời điểm thu hoạch, thời
gian lên men, thời gian sấy khô, số lần và thời gian đảo trộn trong suốt quá trình lên men có ảnh hưởng lớn đến chất lượng hạt ca cao sau lên men [21].
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
KẾT LUẬN
Đề tài đã thu được một số kết quả như sau:
1. Kết quả trung bình thành phần hóa học cơ bản của hạt ca cao và cơm nhầy ở
tỉnh Đăk Lăk là: hàm lượng nước 86,58 %, tỷ lệ cơm/hạt lên men 2,59%, hàm lượng glucid 10,54%, hàm lượng protein 0,67%. Trong đó, mẫu lên men đạt chất lượng
cao nhất có hàm lượng nước 85,85%, tỷ lệ cơm/hạt lên men là 2,68%, hàm lượng
glucid và protein lần lượt là 10,996% và 0,75%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Có sự biến đổi của pH và nhiệt độ của khối hạt trong suốt quá trình lên men. Mẫu có nhiệt độ cao nhất trong suốt quá trình lên men cũng là mẫu có chất lượng
cao nhất trong các mẫu nghiên cứu.
3. Trong 12 mẫu nghiên cứu, mẫu có số lượng nấm men cao thứ hai và số lượng các nhóm vi khuẩn acetic và vi khuẩn lactic cao nhất đồng thời cũng là mẫu
có chất lượng tốt nhất với tỷ lệ hạt lên men hoàn toàn là 93,33 %.
4. Định danh được 4 chủng vi sinh vật chủ yếu thuộc 3 nhóm (nấm men, vi
khuẩn acetic, vi khuẩn lactic) là Pichia sp., Saccharomyces sp., Acetobacter sp., Lactobacillus sp.
ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
Do thời gian và kinh phí thực hiện thí nghiệm còn hạn chế nên kết quả thu được chưa thực sự trọn vẹn. Từ kết quả nghiên cứu xin được đề xuất một số ý kiến
sau:
1.Tiến hành lên men với khối lượng mẫu lớn để nhiệt độ của khối hạt trong quá
trình lên men cao hơn và ổn định hơn.
2.Bố trí thí nghiệm để khẳng định vai trò của các chủng định danh đến chất lượng hạt ca cao sau lên men.
3.Nghiên cứu và xác định thời điểm thích hợp để bổ sung thêm một số chủng vi
TÀI LIỆU THAM KHẢO