L ỜI CẢM ƠN
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Quả ca cao sau khi thu mua được đập bỏ vỏ, tách hạt để phục vụ cho quá
trình lên men. Lấy từ khối hạt trên một phần mẫu nhỏ để xác định thành phần nguyên liệu ban đầu, phần còn lại được đưa đi lên men, thời gian lên men 6 ngày.
Trong quá trình lên men, sau 24h lại lấy mẫu một lần để phân tích vi sinh,
các chủng vi sinh sau khi được phân lập thì được đưa đi giữ chủng để phục vụ cho
quá trình nghiên cứu.
Sau khi lên men hạt được ngâm trong nước 2h với mục đích làm giảm độ
chua của hạt. Sau đó hạt được đưa đi phơi khô và cuối cùng là cắt hạt để đánh giá
chất lượng hạt sau lên men.
Thời gian phơi hạt 6-8 ngày. Không nên kéo dài thời gian này vì nó sẽ làm hạt bị mốc, giảm chất lượng hạt sau lên men. Tuy nhiên cũng không nên làm khô trong một thời gian quá ngắn vì nó làm hạt bị khô không đều, chất lượng hạt không đảm bảo.
Ca cao
Xác định thành phần
nguyên liệu ban đầu
Làm khô tự nhiên Lên men
Đánh giá chất lượng
Ngâm trong nước (2h)
Lấy mẫu định kỳ sau mỗi 24 giờ
Giữ chủng
Đếm và phân lập các chủng vi sinh
2.2 Xác định thành phần hóa học ban đầu của nguyên liệu
Đập quả, tách hạt, lên men tự nhiên trong thùng xốp. Lấy một phần hạt ca cao tươi trước khi lên men để xác định thành phần hóa học ban đầu.
Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định một số thành phần, tính chất
của nguyên liệu
Xác định một số thành phần hóa học chính của cơm nhầy trước khi lên men
như xác định hàm lượng nước trong cơm nhầy, xác định hàm lượng glucid, hàm
lượng đạm tổng số, tỷ lệ cơm/hạt ban đầu và đo độ pH, nhiệt độ của khối hạt. - Xác định hàm lượng ẩm của hạt ca cao theo phương pháp sấy [2]. - Xác định hàm lượng chất khô theo phương pháp nung [2].
- Xác định hàm lượng đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl [2]. - Xác định hàm lượng glucid bằng phương pháp Bertran [2].
Theo dõi (tần suất 24 h) sự biến động về nhiệt độ, độ pH trong suốt quá trình lên men. Sau đó vẽ đồ thị thể hiện sự biến đổi của nhiệt độ, độ pH của khối hạt.
Đánh giá chất lượng hạt theo phương pháp cắt hạt [24], làm cơ sở cho việc
đánh giá sự ảnh hưởng của nguyên liệu và các biến đổi của nhiệt độ, độ pH đến chất lượng hạt ca cao sau lên men.
2.3 Đánh giá chất lượng hạt ca cao
Kiểm tra chất lượng hạt sau lên men theo phương pháp cắt hạt [24]. Phân loại, ổn định thành phần (7-9 ngày) Tách vỏ, thu hạt Quả ca cao Xác định hàm lượng đạm tổng số Xác định tỷ lệ cơm/hạt ban đầu Xác định hàm lượng glucid Xác định hàm lượng nước Tách cơm nhầy Đo độ pH, nhiệt độ của khối hạt
Việc kiểm tra chất lượng hạt có thể được thực hiện bằng cách kiểm tra một số đặc tính như kích thước hạt, độ ẩm của khối hạt, sự tổn thương vật lý, sự xâm nhập của côn trùng, màu sắc của bề mặt cắt [24].
Sau đó chúng được phân loại như sau: màu nâu hoàn toàn (lên men hoàn toàn), màu nâu một phần, màu tím một phần (lên men một phần), tím (dưới mức lên men), chai xám (không lên men), bị hư hỏng, bị mốc, hoặc nảy mầm [24].
2.4 Tiến hành đếm và phân lập các chủng vi sinh từ ca cao lên men
2.4.1 Phân lập vi sinh
Chọn ngẫu nhiên 25 g hạt ca cao đang ủ lên men, pha loãng trong 225 ml dung dịch muối sinh lý vô trùng, cấy bề mặt trên đĩa thạch đặc trưng đã chuẩn bị,
nuôi cấy ở nhiệt độ thường từ 3-5 ngày. Chọn ngẫu nhiên 10 khuẩn lạc trên môi
trường đặc trưng khác nhau, định danh sơ bộ xác định tỷ lệ các chủng vi sinh B%.
Mật độ M của các nhóm vi sinh (CFU / g) được tính theo công thức sau [8]. M (CFU / g) = (Ai x Di / V) x B
Trong đó Ai: là số khuẩn lạc trung bình / đĩa ở độ pha loãng Di Di: là độ pha loãng cấy kiểm tra
V : là thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa (ml).
Bố trí thí nghiệm phân lập các nhóm vi sinh
Hình 2.4: Bố trí thí nghiệm đếm và phân lập nấm men, vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic
Các quá trình trên được tiến hành theo trình tự sau:
- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy khác nhau cho các nhóm vi sinh vật khác nhau.
Mẫu ca cao sau lên men
Pha loãng
Nuôi trên môi trường đặc trưng
Môi trường MEA
Môi trường MRS
Môi trường GYC
agar
Chọn chủng có hình dạng đặc trưng
- Lấy mẫu, chuẩn bị nước cất và pha loãng chúng đến nồng độ 10-6.
- Lấy 1ml dịch pha loãng cấy trên các đĩa thạch đã được chuẩn bị sẵn, mỗi nhóm cấy 2 đĩa, đem nuôi và đếm số lượng khuẩn lạc.
- Xác định thời điểm vi sinh vật của từng nhóm có số lượng lớn nhất.
- Phân lập các chủng vi sinh vật chủ yếu trong giai đoạn đó, giữ chủng trên
ống thạch nghiêng, sau đó tiến hành định danh chúng.
- Xác định thời gian phát triển của nấm men, vi khuẩn trong lên men ca cao bằng phương pháp đếm số lượng tế bào [8].
- Phân lập vi sinh bằng kỹ thuật pha loãng [8].
- Kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật bằng phương pháp cấy ria và soi kính hiển vi [8].
- Giữ giống vi sinh vật bằng phương pháp cấy truyền định kỳ trên môi trường [8].
- Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa
thạch [8].
2.4.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm nuôi cấy các chủng vi sinh.
Nấm men
Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào: - Quan sát khuẩn lạc bằng mắt thường.
- Quan sát đặc điểm hình thái tế bào bằng kính hiển vi ở dạng tế bào sống, tế
bào chết nhuộm metylen xanh.
Dựa vào đặc tính nuôi cấy:
Nấm men được nuôi trên môi trường dịch thể sau 24 h lấy ra quan sát sự phát
triển của nấm men trong môi trường dịch thể (tạo thành váng phủ kín, hay không
phủ kín, hay lắng xuống dưới, phần lắng có dạng xốp hay dạng nhầy, hay dạng rắn
chắc (nếu dùng tay đập nhẹ vào đáy ống nghiệm mà cặn nổi lên thì là cặn xốp, nếu
cặn không nổi lên thì cặn rắn).
Dựa vào khả năng lên men saccarose bằng môi trường nước chiết giá đậu
Tiến hành:
+ Đun sôi 200 g giá đậu với 1.000 ml nước trong 30 phút, sau đó lọc lấy dịch
lọc trong rồi thêm nước cho đủ 1.000 ml.
+ Chuẩn bị 3 ống nghiệm, mỗi ống có 10 ml dịch chiết giá đậu và 1% đường saccarose. Sau đó quan sát khả năng tạo bọt trong ống nghiệm, ghi nhận kết quả.
Vi khuẩn acetic
- Quan sát đặc điểm hình thái trên đĩa thạch, nhuộm gram và quan sát hình thái tế bào.
- Xác định hàm lượng acid sinh ra dựa trên đo đường kính vòng trong tạo
thành trên bề mặt thạch với lượng môi trường trên mỗi đĩa là như nhau và các đĩa có đường kính bằng nhau.
Vi khuẩn lactic
Vi khuẩn phát triển trên môi trường MRS đặc trưng, tạo khuẩn lạc, Gram dương, catalase âm tính.
- Quan sát đặc điểm hình thái trên đĩa thạch, nhuộm gram và quan sát hình thái tế bào.
- Thử nghiệm catalase [8]
Thử trên lame: Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít sinh khối từ các chủng trên
đặt lên lame sạch, dàn đều chúng ra, nhỏ 1 giọt H2O2 30% lên phần vi sinh đã dàn. Nếu có hiện tượng sủi bọt khí ghi (+), nếu không có hiện tượng sủi bọt khí ghi (-).
2.5 Định danh các chủng vi sinh bằng phương pháp giải trình tự gen
- Các chủng nấm men, vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic sau khi được làm thuần
bằng phương pháp cấy ria chúng được cấy trên môi trường thạch nghiên trong ống
nghiệm.
- Yêu cầu bề mặt thạch nghiên phải khô ráo, không còn nước.
- Sau khi nuôi các chủng vi sinh trên trong môi trường đặc trưng, chúng phát
triển mạnh trên bề mặt thạch nghiên mới tiến hành gửi mẫu.
- Các ống thạch nghiên được đựng trong các hộp xốp và bao gói kỹ để tránh
tình trạng các ống thủy tinh bị vỡ, gây tạp nhiễm cho mẫu cần định danh.
- Sau đó mẫu được gửi đến phòng xét nghiệm NK-BIOTEK để tiến hành giải
trình tự gen.
- Đối với nấm men sử dụng phương pháp giải trình tự gen 28S rDNA [1]. - Đối với vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic sử dụng phương pháp giải trình tự
gen 16S rDNA [4]
- Sau khi giải trình tự gen kết quả được tra cứu trên BLAST SEARCH.
2.6 Xử lý số liệu và vẽ đồ thị
Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 16.0 (phân tích ANOVA, kiểm định
Ducan với mức khác biệt có ý nghĩa P < 0,05), vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft
CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Chất lượng hạt ca cao sau lên men.
Kiểm tra chất lượng hạt ca cao sau lên men theo phương pháp cắt hạt [24]. Kết quả cắt hạt được sử dụng như một chỉ số của quá trình lên men dựa trên những
biến đổi về màu sắc của hạt ca cao. Đây là tiêu chuẩn kiểm tra được dùng để đánh
giá chất lượng hạt ca cao sử dụng trong chế biến chocolate [13].
Nghiên cứu được tiến hành trên 12 mẫu ca cao lên men. Nguyên liệu sử dụng
trong toàn bộ nghiên cứu này đều được thu mua từ một nguồn thuộc tỉnh Dak-Lak
nhưng chúng có thời gian thu hoạch khác nhau và thời điểm tiến hành lên men khác nhau. Có sự khác nhau trên là do điều kiện không cho phép thực hiện 12 mẫu thí
nghiệm cùng một thời điểm vì vậy tiến hành thực hiện thí nghiệm từng mẫu một, sau đó chọn mẫu có chất lượng cao nhất trong 12 mẫu trên để báo cáo kết quả
nghiên cứu phân lập và định danh các chủng vi sinh có số lượng chủ yếu trong suốt
quá trình lên men hạt ca cao.
Sau khi kiểm tra chất lượng của 12 mẫu lên men bằng phương pháp cắt hạt.
Kết quả của chúng được thể hiện trong đồ thị bên dưới.
Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn % hạt lên men hoàn toàn của 12 mẫu lên men. Các
giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê
Kết quả phân tích ANOVA, phép kiểm định Ducan cho thấy có sự khác biệt
có ý nghĩa (P < 0,05) về tỷ lệ hạt lên men hoàn toàn giữa các mẫu lên men (Hình 3.1: Các giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống
kê (P < 0,05)).
Sau lên men chất lượng hạt ca cao cao hay thấp phụ thuộc vào tỷ lệ % hạt lên men hoàn toàn / tổng số hạt kiểm tra (100 g), tỷ lệ này càng cao đồng nghĩa với chất lượng hạt ca cao sau lên men càng cao, do vậy có thể nói tỷ lệ này quyết định đến
việc xếp loại chất lượng hạt ca cao sau lên men. Qua đồ thị cho thấy ở các mẫu
nghiên cứu ban đầu chất lượng hạt ca cao còn thấp, càng về sau chất lượng của các
mẫu ca cao tăng dần, và mẫu 12 là mẫu có chất lượng cao nhất trong 12 mẫu lên men với số hạt lên men hoàn toàn chiếm 93,33%, cao hơn 37,45% so với mẫu 4. Có sự chênh lệch này có thể là do sự tác động của nhiều yếu tố khác nhau như:
- Thời điểm thu hoạch nguyên liệu ảnh hưởng đến thành phần hóa học của
nguyên liệu trước khi lên men.
- Hoạt động của các nhóm vi sinh vật ảnh hưởng đến quá trình lên men.
Bên cạnh tỷ lệ % hạt lên men hoàn toàn / tổng số hạt kiểm tra (100 g), còn có một số chỉ tiêu khác như: % hạt ca cao lên men một phần, % hạt ca cao dưới mức
lên men và % hạt ca cao không lên men. Dưới đây là đồ thị biễu diễn các tỷ lệ % được đề cập ở trên.
Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn % hạt lên men một phần của 12 mẫu lên men. Các
giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê
Phân tích ANOVA, phép kiểm định Ducan cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa
(P < 0,05) về tỷ lệ hạt lên men một phần giữa 12 mẫu lên men (Hình 3.2: Các giá trị
trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)).
Qua đồ thị cho thấy trong 12 mẫu lên men, mẫu 7 có tỷ lệ % hạt ca cao lên men một phần cao nhất với 14,43%, sau đó đến mẫu 4 là 13,73%, mẫu có tỷ lệ thấp
nhất là mẫu 1 với 4,46%, sau đó đến mẫu 9 là 4,85%. Khoảng cách giữa mẫu có tỷ
lệ cao nhất với mẫu có tỷ lệ thấp nhất là tương đối lớn (9,07%).
Tỷ lệ này quá cao sẽ không được mong đợi trong quá trình lên men vì chúng sẽ ảnh hưởng đến tỷ lệ hạt lên men hoàn toàn, điều đó có nghĩa nếu tỷ lệ chúng quá
cao sẽ làm giảm chất lượng hạt ca cao sau lên men.
Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn % hạt dưới mức lên men của 12 mẫu lên men. Các
giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê
(P < 0,05).
Dựa trên kết quả phân tích ANOVA, phép kiểm định Ducan cho thấy có sự
khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) về tỷ lệ hạt dưới mức lên men giữa 12 mẫu lên men (Hình 3.3: Các giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa
thống kê (P < 0,05)).
Qua đồ thị ta thấy, mẫu 3 có tỷ lệ hạt dưới mức lên men cao nhất, nó chiếm
12,4%, có sự chênh lệch lớn giữa mẫu có tỷ lệ cao nhất và thấp nhất, khoảng cách
chênh lệch là 12,4%. Ở mẫu 12, không có hạt dưới mức lên men, và đây cũng là mẫu có chất lượng cao nhất trong 12 mẫu lên men. Điều đó cho thấy tỷ lệ này càng
Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn % hạt không lên men của 12 mẫu lên men. Các giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).
Phân tích ANOVA, phép kiểm định Ducan cho thấy có sự khác biệt có ý
nghĩa (P < 0,05) về tỷ lệ hạt không lên men giữa các mẫu lên men (Hình 3.4: Các giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)).
Mẫu 1 có tỷ lệ số hạt không lên men cao nhất với 22,32% sau đó đến mẫu 4
với 21,57%. Ở các mẫu nghiên cứu đầu tỷ lệ này cao, càng về cuối tỷ lệ này càng thấp, điều đó đồng nghĩa với việc chất lượng của các mẫu ca cao lên men phía sau
được cải thiện dần, số hạt lên men hoàn toàn tăng.
Trong suốt quá trình lên men, tỷ lệ hạt lên men hoàn toàn cao luôn được mong đợi. Do đó, việc nghiên cứu để nâng cao tỷ lệ này là một việc vô cùng cần
thiết, nó giúp nâng cao được chất lượng hạt ca cao thành phẩm. Dưới đây là hình
Hạt ca cao sau lên men mẫu 12 (1A)
Kết quả cắt hạt mẫu 12
Hình 3.5: Kết quả cắt hạt ca cao
2. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của ca cao trước khi lên men
Việc xác định thành phần hóa học của ca cao ở các mẫu lên men trên nhằm
phục vụ cho việc đánh giá sự ảnh hưởng của nguyên liệu đến chất lượng hạt ca cao sau lên men. Dưới đây là kết quả nghiên cứu một số thành phần hóa học của nguyên liệu trước khi lên men.
Hình 3.6: Hàm lượng protein trong 12 mẫu lên men. Các giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).
Phân tích ANOVA, phép kiểm định Ducan cho thấy có sự khác biệt có ý
nghĩa (P < 0,05) về hàm lượng protein giữa các mẫu lên men (Hình 3.6: Các giá trị
trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)). Mẫu 12 là mẫu có hàm lượng protein cao nhất cũng là mẫu có chất lượng cao nhất