CAP đã bị cấm sử dụng từ năm 2001 theo chỉ thị số 07/2001/CT-BTS nay được thay thế bằng thông tư 15/2009/TT-BNNPTNT của BNN & PTNT ngày 17/3/2009. Tuy nhiên những năm qua vẫn còn tình trạng hải sản khai thác bị nhiễm CAP. Kết quả phân tích hàm lượng CAP của một số nghiên cứu trong và ngoài nước được thể hiện qua bảng 1.4 sau:
Bảng 1.4: Hàm lƣợng CAP (µg/kg) trong hải sản ở Việt Nam Đối tƣợng Địa điểm Địa điểm lấy
mẫu Năm
Tỷ lệ mẫu phát hiện
Hàm lƣợng
CAP (µg/kg) Tài liệu tham khảo
Hải sản Bình Thuận Tàu cá và cơ sở
bảo quản, sơ chế 2006 74/230 - Bình Thuận Today, 2006
Mực ống Bình Thuận Tàu cá và cơ sở
thu mua 2006 2/9 - Bình Thuận Today, 2006
Mực nang Bình Thuận Tàu cá và cơ sở
thu mua 2006 1/1 - Bình Thuận Today, 2007
Mực ống khô Bình Thuận Tàu cá và cơ sở
thu mua 2006 2/2 - Bình Thuận Today, 2006
Hải sản Bình Thuận Tàu cá, cở sở thu
mua, bến cá 2006 30/121 - Hà Yên, 2006
Hải sản Bình Thuận - 2006 7/42 - Thế Nhân, 2006
Hải sản TP HCM Chợ đầu mối 2007 20/110 - Hùng Sơn và cs, 2007
Hải sản TP HCM Chợ đầu mối 2008 6/30 - VASEP, 2008
Cá Một số tỉnh
Đối tƣợng Địa điểm Địa điểm lấy
mẫu Năm
Tỷ lệ mẫu phát hiện
Hàm lƣợng
CAP (µg/kg) Tài liệu tham khảo
Cá Bạc má Vĩnh Long Chợ 2010 1/22 - Tuấn Sáu, 2010
Nguyên liệu
Cá và Chả cá Phú Yên Chợ 2011 5/7 0,1-1,24
CC QLCL NLTS Phú Yên, 2013
Cá đối đỏ Việt Nam - 2012 - 0,858 Bilandžić và cs, 2011
Hải sản Sóc Trăng Chợ 2014 1/110 - Thế Nhân, 2006
Cá Hà Nội Chợ 2014 - 0,02 Phạm Kim Đăng và cs,
2014 (-) Không xác định
Những năm qua liên tiếp nhiều thị trường xuất khẩu lên tiếng cảnh báo các lô hàng hải sản từ Việt Nam vì tình trạng thủy hải sản nhiễm kháng sinh CAP. CAP là loại kháng sinh cấm do những tác hại của nó đến cho cơ thể con người. Tuy nhiên, vì lợi nhuận mà ngư dân sử dụng chất kháng sinh này để bảo quản hải sản được tốt hơn. Việc sử dụng các hóa chất kháng sinh cấm, độc hại trong thời gian đầu đã mang lại lợi nhuận cho một số cá nhân, một vài đại lý nhưng khi trở nên phổ biến thì những rủi ro do nó mang là rất lớn, điển hình như trong thời gian qua, từ doanh nghiệp chế biến đến các nậu vựa, tàu cá, cơ sở sản xuất nước đá đều bị thiệt hại vì có mối liên kết với nhau khi hàng loạt lô hàng xuất khẩu bị trả về gây thiệt hại rất lớn. Vào thời điểm năm 2006 – 2007, đã có nhiều cảnh báo về việc hải sản Việt Nam có thể đánh mất thị trường quan trọng là Nhật Bản vì tình trạng dư lượng kháng sinh. Trước tình hình đó, trong năm 2006 UBND tỉnh và Bộ Thủy sản tỉnh Bình Thuận đã chỉ đạo tiến hành nhiều cuộc kiểm tra liên tiếp vào tháng 8, 9, 11 xử lý việc sử dụng hóa chất, kháng sinh trong khai thác, thu mua, chế biến thủy sản thì các mặt hàng bị nhiễm chủ yếu là mực, bạch tuộc. Qua các đợt kiểm tra và điều tra thì kết quả xác định nguyên nhân ban đầu chính là do ngư dân, cơ sở thu mua đã sử dụng trực tiếp CAP nhằm mục đích bảo quản và kích ngời mực trên các tàu cá và tại các cơ sở thu mua (Nguyễn Hoàng Thái Vinh, 2006).
Không chỉ riêng mặt hàng hải sản ở Bình Thuận nhiễm CAP mà ở Chợ đầu mối Bình Điền, TP HCM qua các đợt kiếm tra tỷ lệ mẫu phát hiện kháng sinh cấm CAP cũng chiếm tỷ lệ lớn. Chợ đầu mối Bình Điền là chợ đầu mối duy nhất cung cấp một lượng hải sản lớn cho TP HCM vì vậy việc hải sản nhiễm CAP cần phải quan tâm đến.
Trong nghiên cứu của Nguyễn Hữu Khánh và Hồ Thị Bích Nhung (2011), kết quả phân tích 33 mẫu cá thu từ tàu cá và nậu vựa của Nguyễn Hữu Khánh, Hồ Thị Bích Nhung (2011) tỷ lệ mẫu nhiễm CAP tại các nậu vựa là 7,7% tương đương với kết quả xét nghiệm của Chi cục Quản lý Chất lượng Nông lâm Thủy sản tỉnh Bình Thuận trong 8 tháng đầu năm 2010 là 8,8% với hàm lượng CAP là
3,6 (µg/kg). Cũng theo báo cáo của EU năm 2011 thì hàm lượng CAP trong cá đối đỏ là 0,858 (µg/kg) và 0,1-1,24 (µg/kg) đối với nguyên liệu cá và chả cá ở chợ Phú Yên.
Nghiên cứu của Phạm Kim Đăng và cs (2014) trên 5 mẫu cá lấy tại các chợ trên địa bàn các quận huyện Long Biên, Gia Lâm, Hoàng Mai, Đông Anh là
Từ những kết quả trên ta thấy rằng việc sử dụng CAP trong khâu khai thác, quá trình thu mua và bảo quản nguyên liệu ở tàu cá, chợ và cơ sở thu mua rất đáng lo ngại vì đây là nguyên liệu nguồn.
Hải sản nhiễm CAP không chỉ ở Việt Nam mà còn là vấn đề của nhiều nước trên thế giới. Hàm lượng CAP của một số nghiên cứu nước ngoài được thể hiện dưới bảng 1.5 sau:
Bảng 1.5: Hàm lƣợng CAP (µg/kg) trong hải sản ở của một số nƣớc khác
Đối tƣợng Địa điểm Năm Hàm lƣợng CAP
(µg/kg) Tài liệu tham khảo
Cá Chỉ Vàng Nhật Bản 2003 0,27 Takino và cs, 2003 Cá Bơn Nhật Bản 2003 0,1 Takino và cs, 2003 Cá Mỹ 2009 0,994 Ran và Bo, 2009 Cá Trung Quốc 2009 0,24 Lu và cs, 2009 Cá Trung Quốc 2009 0,21 Lu và cs, 2009 Cá Croatia 2013 0.00559 ± 0.00196 Bilandžić và cs, 2011 Cá Croatia 2014 0.0189 ± 0.00196 Bilandžić và cs, 2011
1.2.7. Phƣơng pháp xác định Chloramphenicol trong thủy sản
Các phương pháp phân tích để phát hiện và định lượng CAP trong hải sản như: Sắc ký lỏng (LC), Sắc ký khí (GC), khối phổ (MS) và kỷ thuật song song MS. Hiện nay, FDA đã phê chuẩn phương pháp để phát hiện các CAP trong hải sản là HPLC – MS, GC – ECD, GC – MS với giới hạn phát hiện 5ppb trên hải sản. Canada và liên minh Châu Âu đã có phương pháp xác định với giới hạn
phát hiện thấp hơn và có những hành động về các sản phẩm thực phẩm nhập khẩu từ Trung Quốc và Việt Nam. Gần đây, độ nhạy cảm của các phương pháp được tăng lên có giới hạn phát hiện là 1ppb và tiếp tục thay đổi với giới hạn phát hiện là 0,3ppb của Mỹ cũng phù hợp với yêu cầu của Canada và Liên minh Châu Âu (Hsieh, 2008).
Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký có ghép phổ như GC – MS, GC – MS/MS, LC – MS, LC/ MS/ MS có độ nhạy cảm được cải thiện, có độ tin cậy cao.
Trong nghiên cứu này ta đặc biệt tìm hiểu về phương pháp LC/ MS/ MS vì hiện nay phương pháp này đang được sử dụng phổ biến và có nhiều ưu điểm vượt trội như: có độ nhạy cao, tính chính xác cao, đáp ứng yêu cầu của các nước nhập khẩu về giới hạn phát hiện.
1.2.7.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (Nguồn: Phòng Phân tích sắc ký (CASE), 2012) a. Nguyên lý chung.
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó.
Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp. Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của máy khối phổ. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm (-). Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn.
b. Các loại đầu dò khối phổ.
Hiện nay, có bốn kiểu đầu dò khối phổ chính đang được sử dụng bao gồm: - Đầu dò khối phổ bẫy ion (Ion Trap, IT).
- Đầu dò khối phổ cộng hưởng cyclotron sử dụng phép biến đổi Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry, FTICR hay FT-MS).
- Đầu dò khối phổ thời gian bay (Time-of-Flight, TOF) - Đầu dò khối phổ tứ cực (Quadrupole)
c. Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ đầu dò 3 tứ cực
- Nguyên tắc hoạt động:
Sau khi được tách trong hệ thống sắc ký lỏng, mẫu cần phân tích sẽ đi qua một ống dẫn đến đầu dò MS. Tại đây diễn ra quá trình ion hóa trong buồng API với kiểu ESI, APCI hoặc APPI. Ion sinh ra được tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion để đưa vào bộ phân tích khối. Tại bộ phân tích khối, tứ cực thứ nhất sẽ chọn ion mẹ có m/z xác định, các phân mảnh của ion này được tạo ra tại buồng va chạm (collision cell) nhờ tương tác với khí trơ và được phân tích nhờ tứ cực thứ ba, tạo ra tín hiệu đặc trưng tại bộ phận phát hiện ion.
- Cấu tạo đầu dò khối phổ ba tứ cực:
Đầu dò khối phổ ba tứ cực bao gồm 4 bộ phận chính sau:
Nguồn ion hóa tại áp suất khí quyển: đầu dò khối phổ ba tứ cực 6410A có 4 nguồn ion gồm ESI, APCI, APPI và MMI
Hệ quang học ion (ion optics) là một bát cực (octopole) gồm tám thanh hình trục xếp song song có tác dụng như bộ lọc khối để đưa ion vào tứ cực thứ nhất Q1, ngoài ra còn còn có 2 thấu kính nằm trước và sau buồng va đập để hỗ trợ đưa ion vào buồng va đập và tứ cực thứ 3.
Bộ phân tích khối (mass analyzer) gồm một buồng va chạm (collision cell, được xem là tứ cực thứ hai Q2) đặt ở giữa 2 tứ cực (Q1 và Q3).
Đầu dò phát hiện ion (Dual Dynode Detector) gồm có 2 dynode đặt vuông góc với dòng các ion và phân tử trung tính đi ra khỏi bộ phân tích khối.
d. Kỷ thuật chuẩn bị mẫu cho phƣơng pháp sắc ký
Trong các mẫu sinh học, mẫu môi trường thường có thành phần rất phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích khá thấp nên không tương thích cho việc phân tích trực tiếp trên hệ sắc ký. Do vậy, trước khi phân tích mẫu chúng ta cần phải tách, làm giàu các hợp phần của mẫu cần phân tích. Có rất nhiều phương pháp xửlý mẫu như: lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng-lỏng, sắc ký cột, chiết Soxhlet, SPE, xung siêu âm, vi sóng.... nhưng tất cả các phương pháp này đều phải đáp ứng được các tiêu chí:
- Làm sạch mẫu một cách chọn lọc. - Tăng nồng độ lên nhiều lần. - Lượng mẫu không cần nhiều. - Lượng dung môi cần ít.
- Độ thu hồi cao, không gây nhiễu. - Đơn giản, nhanh, giá thành thấp.
Chiết lỏng - lỏng:
Phương pháp chiết lỏng - lỏng là phương pháp làm sạch mẫu thông dụng, dụng cụ thiết bị khá đơn giản nhưng hiệu quả chiết khá cao.
Quá trình chiết lỏng - lỏng dựa trên định luật phân bố Nernst: bất cứ một hợp phần trung tính nào cũng sẽphân bốgiữa hai dung môi không trộn lẫn với tỷ số nồng độ trong hai pha là một hằng số.
Dựa trên các mối liên hệ giữa độ chọn lọc, độc tính dung môi, giá thành, thời gian... mà chúng ta chọn phương pháp chiết mẫu sao cho hiệu quả nhất.
(0.9) n hc A A A K K A: hằng số phân bố
[Abc]: nồng độ của chất A trong pha hữu cơ [An]: nồng độ của chất A trong pha nước
Chiết pha rắn SPE:
Ngày nay, để làm sạch mẫu trong kỹthuật sắc ký người ta thường sử dụng phương pháp chiết pha rắn SPE (chiếm hơn 50% các phương pháp làm sạch mẫu).
Phương pháp chiết pha rắn ứng dụng cho nhiều nền mẫu (matrix) như các loại mẫu môi trường, các loại mẫu dược phẩm, mẫu sinh hóa, mẫu hữu cơ và mẫu thực phẩm.
Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn:
Bước 1. Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tương tác được với chất hấp phụ. Dịch mẫu khi cần thiết phải được lọc hoặc ly tâm trước khi cho vào cột SPE để tránh làm tắc cột.
Bước 2. Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc hấp thu chất phân tích. Thể tích dung môi cần sửdụng khoảng 1mL/100mg chất hấp phụ. Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơn thể tích quy định này sẽ làm tăng nguy cơ pha rắn không được solvat hóa hoàn toàn, kết quả độ thu hồi của mẫu thấp.
Bước 3. Cân bằng cột: Trước khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tương đương với điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi có điều kiện tương đương dung môi chứa mẫu.
Bước 4. Nạp mẫu: mẫu được cho qua cột SPE. Tốc độ dòng chảy của mẫu qua cột khoảng 3ml/phút.
Bước 5. Rửa pha rắn: dùng dung môi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích.
Bước 6. Rửa giải: sử dụng dung môi thích hợp để tách chất cần phân tích ra khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh. Tốc độ này phụ thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc độ khoảng 1ml/phút (Đinh Đăng Huy, 2009).
- Ứng dụng
Phân tích được các chỉ tiêu ở hàm lượng siêu vết (ppb/ppt);
Phân tích dư lượng các loại kháng sinh thuộc nhóm A (theo quy định của châu Âu) như Chloamphenicol, các dẫn suất Nitrofuran, nhóm chất (Fluoro)quinolones, Malachite green hay các chất trong nhóm B như họ Tetracyclines, họ Sulfonamides, nhóm Avermectin… trong thủy hải sản, thức ăn thủy sản, thực phẩm, môi trường…
1.2.7.2. Phƣơng pháp kít ELISA
Những năm gân đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên-kháng thể (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu và được cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method) (Hsieh, 2008).
Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn được gọi bởi một tên gọi khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay)
Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau.
Phuơng pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên – kháng thể (Enzyme – Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) là một công cụ hiệu quả cho mục đích thử nghiệm sàn lọc. Tuy nhiên, có những yêu cầu khắt khe về LOD và độ không đảm bảo đo và các tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả của xét nghiệm. (Nguồn: Phòng Phân tích sắc ký (CASE), 2012)
a.Kít thử Elisa: Kit thử của các hãng R-Biopharm và TAPB.
b. Qui trình chuẩn bị mẫu: Dư lượng CAP trong 3g mẫu đuợc ly trích bằng 6ml ethyl acetate. Dịch chiết đuợc cô đến khô ở 50oC dưới dòng nitơ. Cặn
khô được hoà tan trong 1ml đệm và làm sạch bằng 1ml hexan. Hàm luợng CAP trong dịch chiết đuợc phân tích với kit thử ELISA.
c. Qui trình thử nghiệm với ELISA: qui trình xác định hàm lượng CAP trong dịch chiết trên Elisa tuân thủ theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Mỗi loạt thử nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm và chứng dương để kiểm soát