1.2.1. Nguồn gốc
Chloramphenicol là chất kháng sinh được phát hiện đồng thời do ba nhóm nghiên cứu độc lập với nhau: nhóm của Ehrlich (Parke Davis Comp, 1947), nhóm Gottib (1948) và nhóm Umezawa (1948). Họ Chloramphenicol được coi là họ kháng sinh có cấu trúc đơn giản nhất và ngay từ khi phát hiện rất nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu sản xuất các chất kháng sinh này. Nhờ vậy chỉ trong vòng hai năm người ta đã xác định được cấu trúc phân tử và triển khai thành công nghệ sản xuất ra loại thuốc này. Chloramphenicol được đưa lên tạp chí hàng năm đầu tiên của y học vào năm 1980.
1.2.2. Tính chất
Chloramphenicol (CAP) có tên khoa học là 2,2-dichlor-N-[aR,bR)-b hydroxy-a-hydroxymethyl-4-nitrophenethyl] acetamide.
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của CAP
- Công thức phân tử: C11H12N2Cl2O5 - Khối lượng phân tử: 323.132 g/mol
- Nhiệt độ nóng chảy vào khoảng 150.50C đến 151.50C - Thăng hoa trong chân không cao và nhạy cảm với ánh sáng - Áp suất bay hơi: 1,73.10-12 mmHg
CAP được phân lập từ Streptomyces venezuelae vào năm 1947 và được sử dụng từ những năm 1950, nay được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp. CAP tồn tại ở dạng kết tinh nhỏ hay tinh thể hình kim, hình đĩa hay dạng bột kết tinh màu trắng, trắng xám hay trắng vàng, vị rất đắng, ít tan trong nước, tan nhiều trong methanol, ethanol, dễ tan trong propylene glycol và dung dịch polyetylen glycol 10% trong nước.
pH của dung dịch bão hòa từ 4.5 – 7.5, khá ổn định trong môi trường trung tính hoặc axit vừa, bị phân hủy nhanh trong môi trường kiềm. Tan trong nước ở 250C, có độc, tác dụng lâu dài (Nguyễn Thị Thanh Hương, 2011).
1.2.3. Cơ chế kháng khuẩn
Cơ chế kháng khuẩn của CAP là:
- Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn. - Ức chế chức năng của màng tế bào.
- Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein. - Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic.
CAP có thể xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và gắn với phần 50S của Ribosom ức chế tổng hợp protein làm cho vi khuẩn không tổng hợp được protein dẫn đến yếu đi và chết. Trong vi lập thể của động vật có vú cũng có Ribosom 50S nên sẽ bị ảnh hưởng. Như vậy cho thấy độc tính cao của CAP (Nguyễn Phương Hà, 2011).
Do có một số tác dụng phụ không mong muốn việc ứng dụng CAP trong điều trị có xu hướng giảm dần. Đồng thời, việc sử dụng và kiểm tra phát hiện dư lượng CAP trong thực phẩm trở thành vấn đề rất nhạy cảm, được quy định chặt chẽ và tiến hành giám sát nghiêm ngặt ở nhiều nước, đặc biệt là nước công nghiệp phát triển. Vì CAP tương đối rẻ tiền, hiệu quả cao trong việc chống nhiễm trùng và có thể vượt qua “hàng rào máu não” nên vẫn được sử dụng rộng rãi ở các nước đang phát triển.
1.2.4. Tác dụng và tác hại
CAP là một kháng sinh phổ biến và được sử dụng để chống nhiễm trùng, chống lại khuẩn cầu gram dương, vi khuẩn gram âm hiếu khí và vi khuẩn kị khí. CAP có tác dụng diệt khuẩn trên nhiều vi khuẩn, cũng như Rickettsia, Chlamydia, Mycoplasma (Shi và Yuan, 2008).
CAP được sử dụng bằng đường toàn thân. CAP có thể được phát hiện trong huyết thanh, huyết tương, dịch não tủy, nước tiểu được hấp thu nhanh từ đường tiêu hóa và được phân phối rộng rãi khắp cơ thể. Nó đã được tìm thấy ở phổi, thận, gan, lá lách, dịch màng phổi, tinh dịch, dịch cổ trướng và nước bọt (Splendore và cs, 2013).
CAP gắn kết với khoảng 60% với Protein huyết tương. CAP bị khử chủ yếu ở gan do glucuronyl transferase. Gan chuyển hóa CAP, tạo điều kiện cho thận bài tiết các chất chất không hoạt động ra khỏi cơ thể. Những người có chức năng gan tốt, cho dù tuổi tác và sức khỏe như thế nào cũng dễ bị tích tụ CAP (Nguyễn Phương Hà, 2011).
CAP khi đi vào cơ thể trẻ sơ sinh có thể gây ra “hội chứng tím xám”, đặc biệt là trẻ sinh non. Các triệu chứng bao gồm: da có màu xanh xám, đầy bụng, nôn hoặc hơi thở nhanh, tím xanh, phân xanh, ngủ lịm tiến tới trụy mạch và tử vong. CAP còn ngộ độc cho tủy xương nếu dùng kéo dài. Ngoài ra CAP còn có thể gây suy tủy, thiếu máu không hồi phục.
CAP được dùng cho người như các chế phẩm bôi, đặc biệt là cho mắt như các bệnh viêm kết mạc do vi khuẩn. Bị nhiễm kháng sinh thuộc nhóm CAP có thể làm giảm bạch cầu, vàng da. Viêm dây thần kinh thị giác, viêm thần kinh ngoại biên, mê sảng. Trên hệ tiêu hóa, CAP không chỉ tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh đường ruột mà còn diệt luôn vi khuẩn có lợi cho ruột gây tiêu chảy dẫn đến thiếu nước nghiêm trọng và làm xuất hiện các bệnh thiếu vitamin K do vi khuẩn đường ruột và sự phát triển quá mức của nấm Candida và Clostridium difficile, gây tiêu chảy và viêm đại tràng (Splendore và cs, 2013).
Năm 1980, CAP được coi là chất ung thư cho con người. Năm 1981, theo đánh giá lại của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế, IARC đã kết luận rằng các dữ liệu gây ung thư trên của CAP ở người là không đủ cơ sở để làm chứng cứ và không có dữ liệu trên động vật. Năm 1987 và năm 1990, CAP có những bằng chứng nhất định để kết luận chất này gây ung thư ở động vật thực nghiệm nhưng khả năng ở người là rất hạn chế.
Việc sử dụng CAP quá mức sẽ gây ra nhiều tác hại nghiêm trọng mà chúng ta cũng cần phải kể đến đó gây ô nhiễm môi trường nước, làm phát sinh cơ chế kháng thuốc ở vật nuôi, con người, gây ra dư lượng trong thịt, hải sản,… CAP có thể được thải ra môi trường và có thể được tìm thấy trong dòng chất thải khác nhau là kết quả của việc sử dụng như những dược liệu kháng khuẩn. CAP trong nước không bay hơi, phân hủy, tích tụ trong đất và trầm tích và các loại hải sản có thể hấp thụ vào cơ thể. Có nghĩa là CAP có thể tồn tại trong bề mặt và nước thải như là chất gây ô nhiễm có trong các sản phẩm dược phẩm và chăm sóc cá nhân. Một nghiên cứu về sự tồn tại của kháng sinh trong nước và nước thải nhà máy xử lý nước thải
phát hiện CAP ở nồng độ 0,56mg/l trong nhà máy nước thải và 0,06mg/l trong nước bề mặt (Splendore và cs, 2013).
CAP cũng được sử dụng trong nuôi trong thủy sản, một phần kháng sinh chưa đào thải sẽ tồn dư gây nguy hại đến cơ thể con người và một lượng đáng kể trong thức ăn thừa sẽ thoát ra và lắng đọng vào môi trường, theo thời gian có thể dẫn tới các biến đổi về hệ sinh thái, gây ô nhiễm môi trường, làm cho làm cho vật nuôi bị nhiễm CAP.
CAP có tác dụng kìm khuẩn, nhưng cũng có thể diệt vi khuẩn ở nồng độ cao hoặc đối với các vi khuẩn nhạy cảm nhờ khả năng ức chế quá trình tổng hợp protein của những vi khuẩn này giúp kéo dài sự phân hủy của nguyên liệu, giữ tươi cho nguyên liệu. Vì vậy CAP được sử dụng như một chất bảo quản nguyên liệu hải sản. CAP khi sử dụng bảo quản sản phẩm làm tồn dư một lượng CAP có gây hại cho người sử dụng các sản phẩm hải sản có chứa dư lượng.
Phơi nhiễm hóa chất độc hại trong lương thực, các mặt hàng thủy sản như CAP vào cơ thể con người sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ miễn nhiễm, làm mất khả năng kháng thuốc khi tích tụ lâu ngày và có khả năng gây đột biến, rối loạn nội tiết.
1.2.5. Các quy định có liên quan 1.2.5.1. Quy định của Việt Nam 1.2.5.1. Quy định của Việt Nam
CAP là kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản theo quy định tại Thông tư số 15/2009/TT-BNNPTNT ngày 17/3/2009 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn về việc ban hành danh mục thuốc, hóa chất, kháng sinh cẩm sử dụng, hạn chế sử dụng.
1.2.5.2. Quy định của Châu Âu
Liên minh Châu Âu (EU) đã ban hành quyết định số 2377/90 EC nay được thay bằng quyết định 37/2010 quy định giới hạn tồn dư thuốc thú y cho phép trong sản phẩm động vật (CE, 1990; 2010). Giới hạn: Không cho phép. Giới hạn phân tích tối thiểu của phương pháp (MRPL) = 0,3µg/kg căn cứ pháp lý Quyết định 2003/181/EC.
1.2.6. Tình hình nhiễm Chloramphenicol trong hải sản khai thác
CAP đã bị cấm sử dụng từ năm 2001 theo chỉ thị số 07/2001/CT-BTS nay được thay thế bằng thông tư 15/2009/TT-BNNPTNT của BNN & PTNT ngày 17/3/2009. Tuy nhiên những năm qua vẫn còn tình trạng hải sản khai thác bị nhiễm CAP. Kết quả phân tích hàm lượng CAP của một số nghiên cứu trong và ngoài nước được thể hiện qua bảng 1.4 sau:
Bảng 1.4: Hàm lƣợng CAP (µg/kg) trong hải sản ở Việt Nam Đối tƣợng Địa điểm Địa điểm lấy
mẫu Năm
Tỷ lệ mẫu phát hiện
Hàm lƣợng
CAP (µg/kg) Tài liệu tham khảo
Hải sản Bình Thuận Tàu cá và cơ sở
bảo quản, sơ chế 2006 74/230 - Bình Thuận Today, 2006
Mực ống Bình Thuận Tàu cá và cơ sở
thu mua 2006 2/9 - Bình Thuận Today, 2006
Mực nang Bình Thuận Tàu cá và cơ sở
thu mua 2006 1/1 - Bình Thuận Today, 2007
Mực ống khô Bình Thuận Tàu cá và cơ sở
thu mua 2006 2/2 - Bình Thuận Today, 2006
Hải sản Bình Thuận Tàu cá, cở sở thu
mua, bến cá 2006 30/121 - Hà Yên, 2006
Hải sản Bình Thuận - 2006 7/42 - Thế Nhân, 2006
Hải sản TP HCM Chợ đầu mối 2007 20/110 - Hùng Sơn và cs, 2007
Hải sản TP HCM Chợ đầu mối 2008 6/30 - VASEP, 2008
Cá Một số tỉnh
Đối tƣợng Địa điểm Địa điểm lấy
mẫu Năm
Tỷ lệ mẫu phát hiện
Hàm lƣợng
CAP (µg/kg) Tài liệu tham khảo
Cá Bạc má Vĩnh Long Chợ 2010 1/22 - Tuấn Sáu, 2010
Nguyên liệu
Cá và Chả cá Phú Yên Chợ 2011 5/7 0,1-1,24
CC QLCL NLTS Phú Yên, 2013
Cá đối đỏ Việt Nam - 2012 - 0,858 Bilandžić và cs, 2011
Hải sản Sóc Trăng Chợ 2014 1/110 - Thế Nhân, 2006
Cá Hà Nội Chợ 2014 - 0,02 Phạm Kim Đăng và cs,
2014 (-) Không xác định
Những năm qua liên tiếp nhiều thị trường xuất khẩu lên tiếng cảnh báo các lô hàng hải sản từ Việt Nam vì tình trạng thủy hải sản nhiễm kháng sinh CAP. CAP là loại kháng sinh cấm do những tác hại của nó đến cho cơ thể con người. Tuy nhiên, vì lợi nhuận mà ngư dân sử dụng chất kháng sinh này để bảo quản hải sản được tốt hơn. Việc sử dụng các hóa chất kháng sinh cấm, độc hại trong thời gian đầu đã mang lại lợi nhuận cho một số cá nhân, một vài đại lý nhưng khi trở nên phổ biến thì những rủi ro do nó mang là rất lớn, điển hình như trong thời gian qua, từ doanh nghiệp chế biến đến các nậu vựa, tàu cá, cơ sở sản xuất nước đá đều bị thiệt hại vì có mối liên kết với nhau khi hàng loạt lô hàng xuất khẩu bị trả về gây thiệt hại rất lớn. Vào thời điểm năm 2006 – 2007, đã có nhiều cảnh báo về việc hải sản Việt Nam có thể đánh mất thị trường quan trọng là Nhật Bản vì tình trạng dư lượng kháng sinh. Trước tình hình đó, trong năm 2006 UBND tỉnh và Bộ Thủy sản tỉnh Bình Thuận đã chỉ đạo tiến hành nhiều cuộc kiểm tra liên tiếp vào tháng 8, 9, 11 xử lý việc sử dụng hóa chất, kháng sinh trong khai thác, thu mua, chế biến thủy sản thì các mặt hàng bị nhiễm chủ yếu là mực, bạch tuộc. Qua các đợt kiểm tra và điều tra thì kết quả xác định nguyên nhân ban đầu chính là do ngư dân, cơ sở thu mua đã sử dụng trực tiếp CAP nhằm mục đích bảo quản và kích ngời mực trên các tàu cá và tại các cơ sở thu mua (Nguyễn Hoàng Thái Vinh, 2006).
Không chỉ riêng mặt hàng hải sản ở Bình Thuận nhiễm CAP mà ở Chợ đầu mối Bình Điền, TP HCM qua các đợt kiếm tra tỷ lệ mẫu phát hiện kháng sinh cấm CAP cũng chiếm tỷ lệ lớn. Chợ đầu mối Bình Điền là chợ đầu mối duy nhất cung cấp một lượng hải sản lớn cho TP HCM vì vậy việc hải sản nhiễm CAP cần phải quan tâm đến.
Trong nghiên cứu của Nguyễn Hữu Khánh và Hồ Thị Bích Nhung (2011), kết quả phân tích 33 mẫu cá thu từ tàu cá và nậu vựa của Nguyễn Hữu Khánh, Hồ Thị Bích Nhung (2011) tỷ lệ mẫu nhiễm CAP tại các nậu vựa là 7,7% tương đương với kết quả xét nghiệm của Chi cục Quản lý Chất lượng Nông lâm Thủy sản tỉnh Bình Thuận trong 8 tháng đầu năm 2010 là 8,8% với hàm lượng CAP là
3,6 (µg/kg). Cũng theo báo cáo của EU năm 2011 thì hàm lượng CAP trong cá đối đỏ là 0,858 (µg/kg) và 0,1-1,24 (µg/kg) đối với nguyên liệu cá và chả cá ở chợ Phú Yên.
Nghiên cứu của Phạm Kim Đăng và cs (2014) trên 5 mẫu cá lấy tại các chợ trên địa bàn các quận huyện Long Biên, Gia Lâm, Hoàng Mai, Đông Anh là
Từ những kết quả trên ta thấy rằng việc sử dụng CAP trong khâu khai thác, quá trình thu mua và bảo quản nguyên liệu ở tàu cá, chợ và cơ sở thu mua rất đáng lo ngại vì đây là nguyên liệu nguồn.
Hải sản nhiễm CAP không chỉ ở Việt Nam mà còn là vấn đề của nhiều nước trên thế giới. Hàm lượng CAP của một số nghiên cứu nước ngoài được thể hiện dưới bảng 1.5 sau:
Bảng 1.5: Hàm lƣợng CAP (µg/kg) trong hải sản ở của một số nƣớc khác
Đối tƣợng Địa điểm Năm Hàm lƣợng CAP
(µg/kg) Tài liệu tham khảo
Cá Chỉ Vàng Nhật Bản 2003 0,27 Takino và cs, 2003 Cá Bơn Nhật Bản 2003 0,1 Takino và cs, 2003 Cá Mỹ 2009 0,994 Ran và Bo, 2009 Cá Trung Quốc 2009 0,24 Lu và cs, 2009 Cá Trung Quốc 2009 0,21 Lu và cs, 2009 Cá Croatia 2013 0.00559 ± 0.00196 Bilandžić và cs, 2011 Cá Croatia 2014 0.0189 ± 0.00196 Bilandžić và cs, 2011
1.2.7. Phƣơng pháp xác định Chloramphenicol trong thủy sản
Các phương pháp phân tích để phát hiện và định lượng CAP trong hải sản như: Sắc ký lỏng (LC), Sắc ký khí (GC), khối phổ (MS) và kỷ thuật song song MS. Hiện nay, FDA đã phê chuẩn phương pháp để phát hiện các CAP trong hải sản là HPLC – MS, GC – ECD, GC – MS với giới hạn phát hiện 5ppb trên hải sản. Canada và liên minh Châu Âu đã có phương pháp xác định với giới hạn
phát hiện thấp hơn và có những hành động về các sản phẩm thực phẩm nhập khẩu từ Trung Quốc và Việt Nam. Gần đây, độ nhạy cảm của các phương pháp được tăng lên có giới hạn phát hiện là 1ppb và tiếp tục thay đổi với giới hạn phát hiện là 0,3ppb của Mỹ cũng phù hợp với yêu cầu của Canada và Liên minh Châu Âu (Hsieh, 2008).
Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký có ghép phổ như GC – MS, GC – MS/MS, LC – MS, LC/ MS/ MS có độ nhạy cảm được cải thiện, có độ tin cậy cao.
Trong nghiên cứu này ta đặc biệt tìm hiểu về phương pháp LC/ MS/ MS vì hiện nay phương pháp này đang được sử dụng phổ biến và có nhiều ưu điểm vượt trội như: có độ nhạy cao, tính chính xác cao, đáp ứng yêu cầu của các nước nhập khẩu về giới hạn phát hiện.
1.2.7.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (Nguồn: Phòng Phân tích sắc ký (CASE), 2012) a. Nguyên lý chung.
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó.
Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương