- Chèn các giếng vào giá ñỡ với số lượng ñủ dùng cho tất cả chuẩn và mẫu ñể
phân tích lặp lại hai lần. Ghi lại vị trí của chuẩn và mẫu.
- Nhỏ 50µl dung dịch chuẩn hoặc dịch mẫu ñã ñược chuẩn bị vào các giếng (nhỏ lặp lại hai lần cho mỗi chuẩn và mẫu, sử dụng ñầu tip mới cho các chuẩn và mẫu khác nhau).
- Nhỏ 50µl dung dịch enzyme gắn kết vào ñáy mỗi giếng.
- Nhỏ 50µl dung dịch kháng thể vào mỗi giếng, trộn nhẹ bằng cách lắc bằng tay và ñem ủở nhiệt ñộ phòng (20-250C/68-770F).
- ðổ chất lỏng ra khỏi giếng và ñập 3 lần giá ñỡ giếng lên một tấm giấy thấm theo một hàng ñể loại bỏ hoàn toàn chất lỏng có trong giếng. Nhỏ vào mỗi giếng 250µl dung dịch ñệm rửa và ñổ chất lỏng ñi lần nữa. Lặp lại như trên thêm hai lần nữa.
- Nhỏ 100µl dung dịch cơ chất/chất tạo mầu vào mỗi giếng. Trộn nhẹ bằng cách lắc nhẹ giá ñỡ giếng bằng tay và ñem ủ ở nhiệt ñộ phòng (20-250C/68- 770F).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...79
- Thêm 100µl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng. Trộn nhẹ bằng cách lắc nhẹ giá ñỡ giếng bằng tay và ño ñộ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 450nm.
ðọc kết quả trong vòng 60 phút sau khi thêm dung dịch dừng phản ứng
3. Kết quả
Giá trị hấp thụ trung bình của chuẩn và mẫu ñược tính bằng cách lấy ñộ
hấp thụ của chất chuẩn hoặc mẫu chia cho ñộ hấp thụ của mẫu trắng (chuẩn không) và nhân với 100. Như vậy chuẩn không có giá trị hấp thụ là 100% và các giá trị hấp thụ khác ñược tính theo % so với mẫu trắng.
Các giá trị % hấp thụ thu ñược cho các mẫu chuẩn ñược ñưa vào một hệ tọa ñộ trong một ñồ thị bán logarit tương ứng với hàm lượng kháng sinh có trong mẫu (ng/kg). Hàm lượng kháng sinh trong mẫu ño bằng ng/kg (ppt) tương ứng với mức ñộ hấp thụ của mỗi mẫu so với ñường cong chuẩn.
ðể tính ñược hàm lượng kháng sinh thực có trong mẫu cần phải nhân các giá trị nhận ñược từ việc ñọc ñường cong chuẩn với hệ số pha loãng tương ứng.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...80 Phụ lục 4 CÁCH TIẾN HÀNH , TÍNH TOÁN VÀ BIỂU THỊ KẾT QUẢ CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC 1. Cách tiến hành: Gồm các bước sau: a. Chiết tách mẫu
- Mẫu ñược xay ñều và ñồng nhất bằng máy xay thịt.
- Chiết mẫu: Cân 5 gam mẫu ñã nghiền và ñồng nhất cho vào ống ly tâm. Cho vào ñó 25ml dung dịch ñệm Mc livaine/EDTA, lắc 30 giây bằng máy lắc votex. Lắc 15 phút bằng máy lắc quay tròn ở tốc ñộ 300 vòng/phút. Ly tâm ở tốc ñộ 4000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt ñộ 40C bằng máy ly tâm lạnh. - Kết tủa protein: Chuyển dung dịch vào ống thủy tinh 30ml. ðặt ống vào cốc phòng thí nghiệm và ñưa lên máy khuấy từ. Cho từ từ 2,5ml dung dịch axit trichloroacetic 1g/ml vào và khuấy ñều. Sau ñó khuấy nhanh hơn trong 1 phút. Nhấc ống ra khỏi máy khuấy từ. Ly tâm 5 phút ở tốc ñộ 3000 vòng/phút, lọc mẫu qua giấy lọc