3.1 địa ựiểm và thời gian thực hiện
3.1.1. địa ựiểm khảo sát và lấy mẫu: Hà Nội, Hải Dương, Thái Bình, Nam
định, Ninh Bình.
3.1.2. địa ựiểm phân tắch mẫu: mẫu ựược phân tắch tại Phòng thắ nghiệm thuộc Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương 1 Ờ Cục thú y. thuộc Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương 1 Ờ Cục thú y.
3.1.3. Thời gian thực hiện: tiến hành lấy mẫu và thu thập thông tin tại các cơ
sở giết mổ và kinh doanh thịt lợn, thịt gà trên ựịa bàn 5 tỉnh (Hà Nội, Hải Dương, Thái Bình, Nam định, Ninh Bình) bắt ựầu từ tháng 8 năm 2009.
3.2 Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Nghiên cứu, ựiều tra tình hình kinh doanh thịt lợn, thịt gà tại các chợ và cơ
sở giết mổ trên ựịa bàn 5 tỉnh Hà Nội, Hải Dương, Thái Bình, Nam định, Ninh Bình.
3.2.2. Nghiên cứu, phân tắch xác ựịnh hàm lượng một số kháng sinh như: Tetracycline, Chloramphenicol, Sulphamethazine tồn dư trong thịt lợn trên Tetracycline, Chloramphenicol, Sulphamethazine tồn dư trong thịt lợn trên
ựịa bàn 5 tỉnh miền Bắc.
- đánh giá mức ựộ tồn dư kháng sinh trong thịt lợn giữa các tỉnh nghiên cứu.
3.2.3. Nghiên cứu, phân tắch xác ựịnh hàm lượng một số kháng sinh như: Tylosin, Enrofloxacine, Streptomycine tồn dư trong thịt gà trên ựịa bàn 5 tỉnh. Tylosin, Enrofloxacine, Streptomycine tồn dư trong thịt gà trên ựịa bàn 5 tỉnh. - đánh giá mức ựộ tồn dư kháng sinh trong thịt gà giữa các tỉnh nghiên cứu.
3.2.4. Nghiên cứu, ựánh giá sự tồn dư kháng sinh trong thịt lợn, thịt gà theo nguồn gốc thịt (nội tỉnh, ngoại tỉnh) tại các tỉnh nghiên cứu. nguồn gốc thịt (nội tỉnh, ngoại tỉnh) tại các tỉnh nghiên cứu.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...35
nơi giết mổ (lò mổ tập trung, ựiểm giết mổ nhỏ lẻ) tại các tỉnh nghiên cứu.
3.2.6. đề xuất một số biện pháp nhằm giảm thiểu sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi. sản phẩm chăn nuôi.
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp lấy mẫu:
Mẫu ựược thu thập tại các cơ sở giết mổ và kinh doanh thịt lợn, thịt gà tại các tỉnh Hà Nội, Hải Dương, Thái Bình, Nam định, Ninh Bình.
Mẫu thịt ựược thu thập một cách ngẫu nhiên tại các cửa hàng kinh doanh và cơ sở giết mổ ựược lựa chọn. Mỗi mẫu là một miếng nạc tươi với trọng lượng 250 - 300 gam. Mẫu ựược lấy một lần vào các buổi sáng. Sau khi lấy mẫu, mẫu ựược ựựng vào túi nilong, dán nhãn, ựựng trong hộp xốp, bảo quản
ở nhiệt ựộ không quá 40C và ựược vận chuyển về phòng thắ nghiệm càng sớm càng tốt. Nếu mẫu không ựược phân tắch ngay, phải bảo quản mẫu ở nhiệt ựộ
-200C. Số lượng và sự phân bố mẫu theo các tỉnh như bảng sau:
Số mẫu thịt lợn (n=75) Số mẫu thịt gà (n=75) Tỉnh/thành phố Cửa hàng kinh doanh Cơ sở giết mổ Cửa hàng kinh doanh Cơ sở giết mổ Hà Nội 11 4 12 3 Hải Dương 12 3 13 2 Thái Bình 12 3 13 2 Nam định 14 1 13 2 Ninh Bình 12 3 13 2 Tổng số 61 14 64 11 ` 3.3.2 Phương pháp phân tắch
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...36
Tiếp theo, các mẫu có kết quả dương tắnh ựó ựược phân tắch khẳng ựịnh và
ựịnh lượng bằng phương pháp HPLC.
3.3.2.1. Phương pháp ELISA: sử dụng kit Max SignalTM của Bioo ScientificTM (Mỹ). ScientificTM (Mỹ).
Elisa (Enzyme - Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme Immuno Assay) là một kỹ thuật sinh hóa ựể phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay Elisa ựược sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và ựặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học. Nguyên lý của Elisa chắnh là dựa vào tắnh ựặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:
(1) Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết ựược gắn trên một bề mặt;
(2) Kháng thể - antibody (KT) biết trước ựược "rửa" qua bề mặt ựó. Kháng thể này ựược gắn kết với enzyme;
(3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến ựổi cơ chất này và tạo tắn hiệu có thể xác ựịnh ựược. đối với các Elisa phát quang, ánh sáng sẽựược phát ra từ mẫu chứa KN - KT. Sự hiện diện của phức hợp KN - KT sẽ quyết
ựịnh cường ựộ sáng phát ra.
Với nguyên lý trên, Elisa giúp xác ựịnh sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu.
để tiến hành Elisa cần phải có ắt nhất một KT ựặc hiệu cho KN chưa biết. Thông thường KN ựược cố ựịnh tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate).
Giữa các bước của Elisa, các protein và các KT không ựặc hiệu, KT không gắn với KN sẽ ựược lấy ựi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn KT liên kết với KN ựược giữ lại. Sau khi ựược thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với KT trong phức
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...37
hợp KT - KN. Phản ứng phát quang (biến ựổi cơ chất) sẽ xảy ra. Cường ựộ
màu ựược ựo bằng máy quang phổở bước sóng 450nm. độ hấp thụ ánh sáng tỷ lệ nghịch với nồng ựộ chất cần phân tắch. Từ ựó suy ra, lượng kháng nguyên chưa biết (chất cần phân tắch) là bao nhiêu.
3.3.2.2 Phương pháp HPLC
HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái ựầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao(High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography). Phương pháp này ra ựời từ năm 1967 - 1968 trên cơ sở
phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ ựiển. Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện ựại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tắch. Hiện tại, ở Việt Nam, HPLC là một phương pháp phân tắch phổ biến của các phòng thắ nghiệm hóa cho các chuyên ngành khác nhau như dược phẩm, thực phẩm,...
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp chia tách trong
ựó pha ựộng là chất lỏng còn pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn ựã ựược phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng ựã phủ lên một chất mang rắn hay là một chất mang ựã ựược biến ựổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng hiệu năng cao dựa trên nguyên tắc hóa lý (hấp thụ và nhả hấp thụ liên tục chất hấp thụ) và dựa vào sự hỗ trợ của các thiết bị
dựa trên nguyên tắc quang ựiện ựể phát hiện ra nồng ựộ của chất phân tắch.
3.4 Phương pháp xử lý số liệu
- Bảo quản số liệu bằng chương trình Excel.
- Sử dụng gói phần mềm thống kê SPSS phiên bản 11.0 và EpiCalc 2000 phiên bản 1.02 ựể phân tắch số liệu.
- Thống kê mô tả: sử dụng tỷ lệ phần trăm (%).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...38
số Odds ựể so sánh tỷ lệ phần trăm mẫu thịt lợn, thịt gà dương tắnh giữa nguồn gốc thịt: nội tỉnh với ngoại tỉnh; giữa nơi giết mổ: lò tập trung với ựiểm giết mổ nhỏ lẻ. Mức ựiển hình p≤ 0.05.
3.5 Phương pháp ựánh giá
3.5.1. điều tra, ựánh giá, phân tắch tình hình kinh doanh thịt lợn, thịt gà tại các chợ và cơ sở giết mổ trên ựịa bàn 5 tỉnh dựa vào phiếu ựiều tra thiết kế các chợ và cơ sở giết mổ trên ựịa bàn 5 tỉnh dựa vào phiếu ựiều tra thiết kế
sẵn (phụ lục 2).
3.5.2. đánh giá mức ựộ tồn dư kháng sinh trong thịt theo Quyết ựịnh số 46 /2007/Qđ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế[6] về việc /2007/Qđ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế[6] về việc quy ựịnh giới hạn tối ựa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm. Những kháng sinh nào không quy ựịnh trong Quyết ựịnh 46/2007/Qđ-BYT thì chúng tôi sử dụng tiêu chuẩn Council Regulation (EEC) No.2377/90 ngày 26 tháng 6 năm 1990 ựểựánh giá[30].
Giới hạn tối ựa cho phép ựối với một số loại kháng sinh trong thịt: - Tetracycline: 200 ppb
- Chlorampheniol: 0 - Streptomycin: 600ppb
- Tylosin, Enrofloxacin, Sulfonamides: Không quy ựịnh trong Quyết
ựịnh 46/2007/Qđ-BYT, chúng tôi sử dụng tiêu chuẩn Council Regulation (EEC) No. 2377/90 ngày 26/6/1990[30] ựểựánh giá: 0,1mg/kg (100 ppb).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...39