L ỜI CẢM ƠN
4.6. Hóa nghiệm các chỉ tiêu keo phèn
Keo phèn ựược chế tạo như trong phần phương pháp nghiên cứu và hóa nghiệm tại phòng kiểm nghiệm. Kết quả hóa nghiệm các chỉ tiêu keo phèn ựược trình bày ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Kết quả hóa nghiệm các chỉ tiêu keo phèn
Chỉ tiêu Tiêu chuẩn Kết quả đánh giá
Trạng thái vật lý Trắng, xốp, mịn Trắng, xốp, mịn đạt Hàm lượng VCK (%) > 5,0 5,4 đạt Hàm lượng Al2O3 (%) 3 Ờ 4 4,0 đạt Sức hút < 0,001 0,0006 đạt Ion Cl- < 5ppm < 5 ppm đạt pH 7,2 Ờ 7,4 7,2 đạt
Kết quả hóa nghiệm cho thấy keo phèn ựã ựược chế tạo ựúng quy trình kỹ thuật và ựạt tiêu chuẩn chất lượng.
4.7. Phối trộn vacxin
Sau khi có kết quả kiểm tra thuần khiết và vô trùng của 5 lô canh trùng và kết quả hóa nghiệm keo phèn, chúng tôi lấy canh trùng mỗi lô ựể chế tạo 10 kg vacxin, sử dụng keo phèn (3,2% Al2O3) làm chất bổ trợ với tỷ lệ 20% khối lượng vacxin. Tuy nhiên, theo như kết quả hóa nghiệm keo phèn, hàm lượng Al2O3 là 4%, do vậy khi pha chế vacxin lượng keo phèn chỉ bằng 4/5 lượng keo phèn tắnh toán (3,2% Al2O3) và canh trùng ựược pha loãng với nước sinh lý vô trùng và kết hợp với keo phèn sao cho trong mỗi ml vacxin chứa 10 ổ 0,2 tỷ vi khuẩn. Kết quả thu ựược trình bày ở bảng 4.10.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 62 Bảng 4.10. Kết quả phối trộn vacxin Thành phần Lô vacxin Canh trùng gốc (tỷ VK/ml) Khối lượng canh trùng (kg) Keo phèn (3,2% Al2O3) (kg) Keo phèn (4% Al2O3) (kg) Nước sinh lý (kg) Vacxin (tỷ VK/ml) 1 29,8ổ0,3 3,36 2 1,6 3,04 10,01ổ0,01 2 30,3ổ0,1 3,30 2 1,6 3,10 9,99ổ0,02 3 29,4ổ0,2 3,40 2 1,6 3,00 9,99ổ0,02 4 32,4ổ0,3 3,09 2 1,6 3,31 10,01ổ0,01 5 28,6ổ0,2 3,50 2 1,6 2,90 10,01ổ0,03 Kết quả ở bảng 4.10 cho thấy số lượng vi khuẩn của 5 lô vacxin Tụ huyết trùng gia cầm ựạt 10ổ0,01 tỷ vi khuẩn/ml. Theo tiêu chuẩn của Công ty, các lô vacxin này ựều ựạt tiêu chuẩn về ựộ ựậm kháng nguyên 10 ổ 0,2 tỷ vi khuẩn. 4.8. Kiểm nghiệm vacxin Tụ huyết trùng gia cầm Theo quy ựịnh, bất cứ vacxin nào trước khi xuất xưởng, bắt buộc phải ựủ 3 chỉ tiêu: vô trùng, an toàn và hiệu lực. đây là những chỉ tiêu chắnh và không thể thiếu trong kiểm nghiệm ựối với mỗi loại vacxin. 4.8.1. Kiểm tra vô trùng vacxin Sau khi ra chai, chúng tôi lấy mỗi lô 3 chai ựể kiểm tra trên các môi trường cơ bản, kết quả kiểm tra vô trùng của 5 lô vacxin ựược trình bày ở bảng 4.11. Bảng 4.11. Kết quả kiểm tra vô trùng 5 lô vacxin Môi trường kiểm tra Lô vacxin Thạch máu Thạch thường Nước thịt ống Nước thịt gan yếm khắ Nước thịt lọ (50ml) Thạch nấm 1 - - - - 2 - - - - 3 - - - - 4 - - - - 5 - - - - Ghi chú: Ộ-Ợ vô trùng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 63 Kết quả bảng 4.11 cho thấy tất cả các môi trường kiểm tra, không có bất cứ loại vi sinh vật nào mọc. điều ựó chứng tỏ mọi thao tác trong quá trình sản xuất vacxin ựều ựảm bảo vô trùng. Như vậy, tất cả các lô vacxin ựều ựảm bảo tiêu chuẩn vô trùng. Chúng tôi tiếp Tục kiểm tra các chỉ tiêu an toàn và hiệu lực của vacxin.
4.8.2. Kết quả kiểm tra an toàn
Chỉ tiêu an toàn là một trong những chỉ tiêu quan trọng khi ựánh giá chất lượng của vacxin. Một vacxin ựược cho là an toàn khi tiêm cho bản ựộng vật với lượng vacxin bằng hoặc gấp ựôi liều sử dụng, ựộng vật không bị chết và không có bất cứ triệu chứng lâm sàng nào có thể quan sát ựược sau khi tiêm vacxin.
Kết quả kiểm tra an toàn của các lô vacxin Tụ huyết trùng gia cầm ựược trình bày ở bảng 4.12.
Bảng 4.12. Kết quả kiểm tra an toàn vacxin Tụ huyết trùng gia cầm
Lô vacxin Số mẫu kiểm tra Tổng số gà kiểm tra Liều tiêm ml/con Kết quả theo dõi (Số gà bình thường/ Số gà tiêm) Tỷ lệ an toàn (%) 1 3 6 2 6/6 100 2 3 6 2 6/6 100 3 3 6 2 6/6 100 4 3 6 2 6/6 100 5 3 6 2 6/6 100
Kết quả bảng 4.12 cho thấy trên tổng số 30 gà thắ nghiệm ựược tiêm an toàn với 5 lô vacxin Tụ huyết trùng gia cầm không có bất cứ phản ứng bất thường nào, gà sống khoẻ mạnh và phát triển bình thường. Như vậy, kết luận cả 5 lô vacxin Tụ huyết trùng gia cầm ựều ựạt chỉ tiêu an toàn.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 64
4.8.3. Kết quả kiểm tra hiệu lực
Hiệu lực của vacxin là khả năng vacxin kắch thắch cơ thể sản sinh kháng thể, ựể cơ thể có một trạng thái miễn dịch tốt, chống lại mầm bệnh, bảo vệ ựộng vật ựược sau khi ựược tiêm phòng. Hiệu quả phòng bệnh của vacxin phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong ựó hiệu lực của vacxin ựược ựánh giá là yếu tố quyết ựịnh. Vì vậy, kiểm tra hiệu lực của vacxin là công việc không thể thiếu trong quá trình nghiên cứu một vacxin mới, cũng như quá trình sản xuất vacxin phòng bệnh.
Chúng tôi tiến hành kiểm tra hiệu lực với 5 lô vacxin. Kết quả trình bày ở bảng 4.13.
Bảng 4.13. Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin Tụ huyết trùng gia cầm
Lô vacxin Li ều công thực tế Số lượng gà Tr ạng thái
sau khi tiêm S
ố con sống T ỷ lệ sống (%) 1 4 Bình thường 4 100 2 4 Bình thường 3 75 3 4 Bình thường 4 100 4 4 Bình thường 4 100 5 4 Bình thường 3 75 đC 305 2 0 0
Kết quả ở bảng 4.13 cho thấy quá trình công cường ựộc ựạt yêu cầu, cụ thể số lượng vi khuẩn tiêm sát với lý thuyết, gà ựối chứng chết trong thời gian 1 Ờ 2 ngày sau khi tiêm vi khuẩn và triệu chứng, bệnh tắch ựiển hình của bệnh Tụ huyết trùng gia cầm. Tất cả các lô vacxin ựều ựạt tỷ lệ bảo hộ miễn dịch trên 75%.
Như vậy, 5 lô vacxin Tụ huyết trùng gia cầm ựều ựạt các chỉ tiêu kiểm nghiệm. để có kết quả chắnh xác hơn, chúng tôi tiếp Tục ựánh giá chất lượng vacxin trên thực ựịa.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 65
4.9. đánh giá chất lượng vacxin trên thực ựịa
4.9.1. Kết quả kiểm tra an toàn trên thực ựịa
Sau khi có kết quả kiểm nghiệm vacxin tại phòng kiểm nghiệm của trung tâm, chúng tôi lấy mẫu tiêm cho 600 gà tại 2 gia ựình huyện Khoái Châu, 3 gia ựình huyện Văn Lâm tỉnh Hưng Yên và 1 trang trại huyện Quế Võ, tỉnh Bắc Ninh. Tại mỗi huyện, chúng tôi tiêm cho 200 gà, trong ựó 50 con ựược tiêm 2 ml ựể kiểm tra an toàn, số gà còn lại ựược tiêm 1 ml ựể kiểm tra hiệu lực. Theo dõi gà ựược tiêm trong 10 ngày, kết quả thu ựược trình bày ở bảng 4.14.
Bảng 4.14. Kết quả kiểm tra an toàn trên thực ựịa
Kết quả theo dõi địa ựiểm Số gà tiêm (con) Li ều tiêm (ml) Gà bình thường (con) Gà ch ết (con) Tỷ lệ an toàn (%) Khoái Châu 50 2 50 0 100 Văn Lâm 50 2 50 0 100 Quế Võ 50 2 50 0 100
Qua bảng 4.14 cho thấy gà ựược tiêm phòng vacxin ựều an toàn, phát triển bình thường và không có biểu hiện bất thường nào như bỏ ăn, mệt, ủ rũ. Như vậy cả 5 lô vacxin ựều ựạt chỉ tiêu an toàn trên thực ựịa.
4.9.2. Kết quả kiểm tra hiệu lực trên thực ựịa
để ựánh giá hiệu lực vacxin Tụ huyết trùng trên thực ựịa, sau 21 ngày tiêm vacxin, bắt ngẫu nhiên mỗi ựịa ựiểm ựược tiêm phòng 20 gà ựược miễn dịch (4 gà/lô vacxin) và 2 gà chưa ựược tiêm phòng về công ty ựể công cường ựộc với vi khuẩn Tụ huyết trùng. Liều công 300 vi khuẩn vào dưới da, theo dõi 7 ngày. Kết quả ựánh giá hiệu lực vacxin ựược tổng hợp dưới bảng 4.15.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 66
Bảng 4.15. Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin trên thực ựịa
địa ựiểm vacxin Lô Số gà tiêm (con) Số gà s(con) ống Số gà ch(con) ết T
ỷ lệ bảo hộ (%) 1 4 4 0 100 2 4 3 1 75 3 4 3 1 75 4 4 4 0 100 5 4 4 0 100 Khoái Châu đC 2 0 2 0 1 4 4 0 100 2 4 4 0 100 3 4 4 0 100 4 4 3 1 75 5 4 3 1 75 Văn Lâm đC 2 0 2 0 1 4 3 1 75 2 4 4 0 100 3 4 4 0 100 4 4 4 0 100 5 4 3 1 75 Quế Võ đC 2 0 2 0
Kết quả bảng 4.15 cho thấy tất cả các lô vacxin Tụ huyết trùng gia cầm của trung tâm ựều ựạt chỉ tiêu hiệu lực trên thực ựịa với tỷ lệ bảo hộ trên 75%.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 67
Hình ảnh bệnh tắch gà sau khi công cường ựộc
Hình 4.5. Gà chết do Tụ huyết trùng Hình 4.6. Mào, tắch thâm
Hình 4.7. Xoang bao tim tắch nước Hình 4.8. Xuất huyết mỡ vành tim
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 68
Phần V
KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu sản xuất vacxin vô hoạt Tụ huyết trùng gia cầm bằng công nghệ lên men sục khắ tại công ty trách nhiệm hữu hạn dược và vật tư thú y Hanvet, chúng tôi ựưa ra một số kết luận sau:
- Vi khuẩn Tụ huyết trùng gia cầm phát triển tốt trên môi trường BHI có bổ sung huyết thanh, ựường saccharose. Tốc ựộ lắc, tốc ựộ khuấy, áp suất bề mặt, nồng ựộ oxy hòa tan có ảnh hưởng ựến sự phát triển của vi khuẩn Tụ huyết trùng gia cầm.
- Trong ựiều kiện nuôi lắc, hàm lượng ựường thắch hợp cho vi khuẩn là 1,0% và hàm lượng huyết thanh cần thiết là 7,0%, pH 7,2. Vi khuẩn phát triển nhanh trong ựiều kiện nhiệt ựộ 37oC, lắc 200 vòng/phút.
- Thời gian nhân giống cấp I là 7 giờ.
- Trong ựiều kiện lên men, vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường nuôi cấy có bổ sung 1,5% ựường saccharose, 10% huyết thanh. Những ựiều kiện vật lý tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn bao gồm: tốc ựộ khuấy 350 vòng/phút, áp suất bề mặt 0,3 bar, nhiệt ựộ nuôi cấy 37oC, pH = 7,2.
- Thời gian nhân giống cấp II và nhân giống sản xuất là 5 giờ.
- Vô hoạt canh trùng bằng formol (36% formaldehyde) với tỷ lệ 0,1%. - Môi trường thạch Blood Agar có bổ sung 8,0% máu là thắch hợp ựể ựếm số lượng vi khuẩn.
- Vacxin ựạt chỉ tiêu an toàn và hiệu lực trong phòng thắ nghiệm và trên thực ựịa với tỷ lệ bảo hộ trên 75% trong phòng thắ nghiệm và trên 75% ngoài thực ựịa.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 69
5.2. đề nghị
- Tiếp tục nghiên cứu ựể hoàn thiện quy trình sản xuất. - Nghiên cứu thời gian bảo quản vacxin ở nhiệt ựộ 2 Ờ 8oC. - Nghiên cứu ựộ dài miễn dịch của vacxin.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 70
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Nguyễn Xuân Bình, 1994. Tỷ lệ nhiễm bệnh Tụ huyết trùng gia cầm theo lứa tuổi và mùa vụ tại Long An. Tạp chắ khoa học kỹ thuật thú y, tập I, số 4, trang 67 Ờ 71.
Sa đình Chiến, 2001. Nghiên cứu bệnh Tụ huyết trùng ở Sơn La, một số ựặc tắnh của Pasteurella multocida phân lập ựược, biện pháp phòng trị. Luận án tiến sĩ Nông nghiệp, Hà Nội.
Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn đình Chiến, Phạm Văn Ty (2006), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội.
Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2009), Miễn dịch học ứng dụng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, đỗ Ngọc Thúy (2012), Bệnh truyền nhiễm thú y, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Bá Hiên, Phạm Quang Thái, Trần Xuân Hạnh, Nguyễn Hữu Tắn, Bạch Quốc Thắng (2010), Kỹ thuật sử dụng vacxin phòng bệnh cho vật nuôi, NXB Hà Nội.
Phạm Sỹ Lăng, Lê Văn Năm, Tô Long Thành, Cù Hữu Phú (2009), Một số bệnh quan trọng gây hại cho gia cầm, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
Lê Lập, Lê Thị Thi, Phan Thanh Phượng, 1994. Hiệu lực miễn dịch vacxin Tụ huyết trùng gia cầm chủng N41 ở miền Trung Việt Nam. Tạp chắ khoa học kỹ thuật thú y, tập I, số 5, trang 51 Ờ 54.
Nguyễn Thị Mai, Bùi Hữu đoàn, Hoàng Thanh (2009), Giáo trình chăn nuôi gia cầm, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
đỗ Trung Phấn (1979), Miễn dịch trung gian tế bào, NXB Y học Hà Nội. Nguyễn Vĩnh Phước (1964), Vi trùng học thú y, Hà Nội.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 71 Nguyễn Vĩnh Phước, Hồ đình Chúc, Nguyễn Văn Hanh, đặng Thế Huynh (1978), Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
Nguyễn Vĩnh Phước, Hồ đình Chúc, Nguyễn Văn Hanh, đặng Thế Huynh (1978), Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
Phan Thanh Phượng (1989), Cơ sở miễn dịch và dịch tễ ựiều khiển phòng chống ựặc hiệu bệnh Tụ huyết trùng gia súc và gia cầm ở Việt Nam, Luận án Tiễn sỹ khoa học Matxcơva.
Phan Thanh Phượng 2000, Nghiên cứu quá trình ựáp ứng miễn dịch của gia cầm ựược tiêm vacxin vô hoạt Tụ huyết trùng cùng thời ựiểm với kháng sinh.
Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật thú y 1996 Ờ 2000. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
Nguyễn Như Thanh, Phùng Quốc Chướng (2006), Phương pháp thực hành vi sinh vật thú y, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội
Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2001), Vi sinh vật Thú Y, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
Tô Long Thành (2011), Miễn dịch học và ứng dụng miễn dịch liệu pháp trong thú y, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
Nguyễn Mạnh Thắng, Nguyễn Ngọc Hải, Trần đình Từ, 2008. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng ựến sự phát triển của vi khuẩn Pasteurella multocida.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 72
Tiếng Anh
Akand M.S.I., Choudhury K.A., Kabir S.M.L., Sarkar S.K. and Amin K.M.R., 2004. Development of washed cell fowl cholera vaccines in Bangladesh.
International journal of poultry science 3, pp.534 Ờ 537.
Atta Husain Shah, A.A. Kamboh, N.Rajput and N.A. Korejo, 2008.
Optimization of physio-chemical conditions for the growth of Pasteurella multocida under In vitro, Pakistan jounal of agriculture and social sciences. Vol.4, No. 4
Bain R.V.S, De Alwis M.C.L., Carter G.R., Gupta B.K., 1982. Haemorrhagic septicaemia. Animal production and health. Paper 33, FAO, Rome.
Carter G.R., 1952 Typ specific capsular antigens of Pasteurella multocida,
Canadian Journal of Medical Science, pp.48 Ờ 53.
Carter G.R., 1955, Studies on Pasteurella multocida I, a haemagglutination test for indetification of serological type, American Journal of Vet.Reseach, pp.481 Ờ 484.
Carter G.R., 1984, Pasteurella, Yersinia and Francisella. In: Diagnostic procedures in Veterinary Bacteriology and Mycology. 4th ed. Charler. C. Thomas Publisher. Springfield, pp.111 Ờ 121.
Derek T OỖHagan 2000, Vaccines adjuvants. Humana Press, Totowa, New jersey.
Diallo I.S., Frost A.J. (2000). Characteristics of haemolytic extract from avian
P.multocida. Veterinary Microbioly 71, pp. 37 - 45.
Heddleston K.L., Reber P.A. (1972). Fowl cholera: Cross - immunity induced in turkeys with formalin - killed in vivo propagated P.multocia. Avian Dis. 16, pp. 578 Ờ 586
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 73 I. A. Merchant, R. A. Packer (1967), Veterinary bacteriology and virology, The
Iowa State University Press.
Manninger (1919), Concenrning a mutation of the fowl cholera bacillus, Zentralbl, Bakteriol. Abt. I. Orig, 83, pp.520 Ờ 528.
Nandanlpeiris, L.K.P. and M.C.L. De Alwis, 1991. Simplified techniques for haemorrhagic septicemia old adjuvant vaccines production. In: Proceeding of the Forth-International Workshop on Haemorrhagic Septicemia. Kandi, Srilanca. FAO/APHCA Publication 1991 Ờ 13.
Namioka S, Mutara M, (1961), Serologycal studies on Pasteurella multocida I,