L ỜI CẢM ƠN
3.2.9.ánh giá chất lượng vacxin trên thực ñị a
- Chỉ tiêu an toàn - Chỉ tiêu hiệu lực 3.3. Thời gian và ựịa ựiểm nghiên cứu 3.3.1. Thời gian nghiên cứu Từ tháng 6 năm 2012 ựến tháng 6 năm 2013. 3.3.2. địa ựiểm nghiên cứu
đề tài ựược thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu và sản xuất sinh phẩm, Công ty trách nhiệm hữu hạn dược và vật tư thú y Hanvet.
Sản xuất vacxin tại dây chuyền GMP vi khuẩn.
Kiểm nghiệm vacxin tại phòng kiểm nghiệm Công ty.
Kiểm nghiệm trên thực ựịa tại: huyện Khoái Châu, Văn Lâm tỉnh Hưng Yên và huyện Quế Võ tỉnh Bắc Ninh
3.4. Nguyên liệu nghiên cứu
- Giống vi khuẩn Tụ huyết trùng gia cầm cường ựộc.
- động vật thắ nghiệm: gà lương phượng có trọng lượng 1,0 Ờ 2,0kg. - Môi trường nuôi cấy: môi trường BHI+, thạch máu, thạch thường, nước thịt gan yếm khắ, thạch nấm, nước thịtẦ
- Hệ thống lên men 10JS Ờ 100JS. - Hóa chất: formol 36%, thimerosal.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 37
3.5. Phương pháp nghiên cứu
Giống vi khuẩn
Thạch BA huyết thanh
Soi dung quang, phiết kắnh kiểm tra hình thái, tắnh chất bắt màuẦ
Kiểm tra thuần khiết, ựếm số
Kiểm tra thuần khiết, ựếm số
Kiểm tra thuần khiết, ựếm số
Giống cấp II (nồi lên men 10 lắt) Cấy giống sản xuất (nồi lên men 100 lắt) Thạch máu ống Giống cấp I (nuôi lắc) Kiểm tra vô trùng Kiểm tra vô trùng Vô hoạt formol Phối trộn vacxin Ra chai, dán nhãn Thành phẩm
Kiểm tra an toàn Kiểm tra hiệu lực Kiểm tra vô trùng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 38
3.5.1. Phương pháp chọn giống vi khuẩn cấy giống cấp I
Chọn khuẩn lạc.
Lấy một que cấy bạch kim vi khuẩn P. multocida từ giống ựông khô, ria cấy lên ựĩa thạch huyết thanh.
Bỏ vào tủ ấm, sau 18 giờ soi dung quang, chọn khuẩn lạc phát quang tốt, ựặc trưng cho vi khuẩn Tụ huyết trùng gia cầm.
Kiểm tra hình thái qua kắnh hiển vi và cấy vào ống thạch giống.
Kiểm tra hình thái vi khuẩn.
Nhuộm Gram ựể xem hình thái, màu sắc, kắch thước của vi khuẩn. Phương pháp nhuộm Gram ựược thực hiện qua các bước sau: - Nhỏ dung dịch tắm gentian lên tiêu bản ựể 1 phút
- Rửa nước nhanh, vẩy khô - Nhỏ dung dịch Lugol ựể 1 phút - Rửa nước nhanh, vẩy khô
- Nhỏ cồn Axeton từ ựầu phiến kắnh, nghiêng phiến kắnh cho cồn chảy qua vị trắ phết vi khuẩn
- Rửa nước nhanh
- Nhỏ dung dịch fucsin loãng ựể 1 phút - Rửa nước, thấm và sấy khô, xem kắnh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.5.2. Phương pháp xác ựịnh số lượng vi khuẩn
Sau các khâu: cấy giống cấp I, cấy giống cấp II và cấy giống sản xuất sẽ tiến hành ựếm số lượng ựể theo dõi sự phát triển của vi khuẩn.
Xếp một dãy gồm 8 ống nghiệm, dùng bút ựánh số thứ tự từ 10-1 ựến 10-8. Sử dụng pipette loại 5ml hút 4,5ml nước sinh lý 0,9% vào từng ống nghiệm trên.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 39 Dùng pipette loại 1 ml hút 500ộL canh trùng vào ống nghiệm thứ nhất, trộn ựều, thay ựầu côn pipette hút 500ộL từ ống nghiệm thứ nhất sang ống nghiệm thứ hai. Làm như vậy cho ựến ống nghiệm cuối cùng ta ựược dãy ống nghiệm có ựộ pha loãng canh khuẩn theo thứ tự 10-1, 10-2, Ầ , 10-8.
Dùng micropipette loại 200 ộL ựể hút 100 ộL ở ống nghiệm 10-8 và 10-7 cấy lên môi trường thạch ựĩa, ở mỗi nồng ựộ cấy lên 5 ựĩa môi trường. Các ựĩa thạch ựược cho vào tủ ấm 37oC/24 giờ rồi lấy ra ựếm số.
Công thức tắnh như sau:
Trong ựó: A là số vi khuẩn trung bình trong 1 ml canh trùng ởựộ pha loãng thứ n.
N là hệ số pha loãng của canh trùng
3.5.3. Phương pháp nhân giống cấp I
Lấy một que cấy bạch kim vi khuẩn từ ống thạch máu giống cấy vào 60 ml môi trường BHI ựã ựược bổ sung huyết thanh và kiểm tra vô trùng.
Chuyển vào tủ lắc ấm, ở nhiệt ựộ 37oC.
Sau thời gian nuôi cấy thắch hợp trong tủ ấm lắc, các bình giống này ựược kiểm tra thuần khiết, tập trung lại, ựếm số trung bình và chuyển vào nồi lên men ựể nhân giống cấp I.
3.5.4. Phương pháp nhân giống cấp II và nhân giống sản xuất vi khuẩn bằng công nghệ lên men sục khắ công nghệ lên men sục khắ
Phương pháp tiến hành như sau:
Môi trường sau khi ựã hấp ở 116oC/30 phút, hạ nhiệt ựộ xuống 37oC, ựược bổ sung huyết thanh và lấy mẫu kiểm tra vô trùng. Cấy chuyển giống cấp I
Số vi khuẩn trong
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 40 từ bình tam giác vào nồi lên men, quá trình nuôi cấy ựược tự ựộng hóa, các thông tin trong nồi lên men bao gồm: nhiệt ựộ, tốc ựộ khấy, lưu lượng khắ, oxy hoà tanẦ sẽ ựược hiển thị trên máy tắnh.
Sau thời gian nuôi cấy thắch hợp ở nồi lên men 10 lắt, canh trùng sẽ ựược chuyển sang nồi lên men 100 lắt qua ựường dẫn kắn, vô trùng liên kết giữa hai nồi. Quá trình lên men tiếp tục tại nồi lên men 100 lắt và sau thời gian nuôi cấy thắch hợp canh trùng sẽ ựược vô hoạt trong nồi lên men, tiến hành thu hoạch và phối trộn với nước sinh lý và keo phèn theo tỷ lệ yêu cầu.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 41
Hình 3.1. Hệ thống lên men tại công ty Hanvet 1 2 3 4 5 6 7 CHÚ THÍCH 1.Bảng ựiều khiển nồi hơi và bình nén khắ tầng trên
2.Hệ thống nước (nước cất, nước RO, nước máy)
3.đường dẫn khắ
4.đường dẫn hơi
5.Nồi lên men 10 lắt
6.Nồi lên men 100 lắt
7.Màn hình ựiều khiển thông số lên men
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 42
3.5.5. Phương pháp chế tạo keo phèn
Chúng tôi quyết ựịnh dùng chất bổ trợ cho vacxin Tụ huyết trùng gia cầm là keo phèn với các lý do: hiện nay nhiều ựơn vị sản xuất vacxin ựã và ựang sử dụng keo phèn làm chất bổ trợ cho một số loại vacxin vô hoạt như vacxin vô hoạt Tụ huyết trùng lợn, vacxin vô hoạt phó thương hàn lợn. Chế tạo keo phèn ựơn giản, rẻ tiền, chủ ựộng về nguồn nguyên liệu trong nước. Tác dụng của keo phèn khi cho vào vacxin có vai trò là hấp phụ xác vi khuẩn lên bề mặt, qua ựó làm hạn chế hiện tượng sốc sau khi tiêm. Khi tiêm, keo phèn sẽ gây nên phản ứng viêm tại chỗ (phản ứng viêm này mất ựi sau 2 Ờ 3 ngày) không gây hại cho con vật, ngược lại nó giúp cho quá trình ựáp ứng miễn dịch diễn ra nhanh hơn. Keo phèn sau khi hấp phụ kháng nguyên lên bề mặt, nó có tác dụng như một Ộkho kháng nguyênỢ, giải phóng kháng nguyên ra từ từ giúp kéo dài và ổn ựịnh miễn dịch.
Nguyên liệu: Polyaluminum Chloride (PAC) và NaOH. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.5.6.1. Pha chế keo phèn
Cho PAC vào trong thùng Inox ựựng nước cất thành dung dịch 10%. đun sôi cho PAC tan hết, dung dịch trong sau ựó ựể nguội và lọc qua giấy lọc, bảo quản PAC trong bình thủy tinh ựể tránh hiện tượng phản ứng giữa PAC và bình chứa.
Cho dung dịch PAC kết hợp với dung dịch NaOH 1N trong thùng phản ứng. Khi pha, dùng Moteur khuấy 100 Ờ 150 vòng/phút cho dung dịch ựược ựồng ựều. điều chỉnh pH sau khi pha từ 7,8 ựến 8,2.
Sau khi pha xong ựể lắng một ngày ựể cho các hạt keo ựược hình thành. Khuấy ựều và lọc qua túi vải Kaki bằng nước cất từ 6 Ờ 8 lần cho sạch ion Cl-.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 43 Thu mẫu bảo quản trong các hộp có thể tắch 2 lắt ựồng thời lấy mẫu hóa nghiệm.
3.5.6.2. Tiêu chuẩn hóa nghiệm keo phèn
Tiêu chuẩn vật lý: trắng, xốp, mịn. Hàm lượng vật chất khô: > 5% Hàm lượng Al2O3: 3 Ờ 4% Súc hút: < 0,001 pH 7,2 Ờ 7,4 ion Cl-: < 5ppm
3.5.6. Phương pháp phối trộn, ra chai vacxin
Sau khi ựã có kết quả vô hoạt và ựếm số, chúng tôi tiến hành phối trộn vacxin.
Khối lượng canh trùng, nước sinh lý và keo phèn ựược tắnh toán sao cho ựảm bảo 10 tỷ vi khuẩn trong một ml vacxin, keo phèn chiếm 20% khối lượng vacxin theo các công thức sau:
Số lượng CFU/ml canh trùng (109CFU) Pvacxin =
10 ừ Pcanh trùng
Pvacxin
Pkeo phèn = 5
Psinh lý = Pvacxin Ờ Pcanh trùng Ờ Pkeo phèn
Vắ dụ: Có 5 kg canh trùng với số lượng 24ừ109CFU/ml, ta có công thức tắnh như sau:
24 Pvacxin =
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 44 12 Pkeo phèn = 5 = 2,4 (kg) Psinh lý = 12 Ờ 5 Ờ 2,4 = 4,6 (kg)
Sau khi có kết quả như bảng phối trộn trên, keo phèn và nước sinh lý ựược trộn ựều bình Nalgene, dùng máy khuấy từ ựể khuấy ựều sao cho keo phèn tan hết, keo phèn ựược pha cùng với nước sinh lý bởi vì keo phèn ở trạng thái ựặc, có tắnh dẫn nhiệt kém, vì vậy pha loãng keo phèn bằng nước sinh lý sẽ làm cho nhiệt ựộ ựược ựồng ựều trong quá trình hấp ựồng thời keo phèn cũng ựược ựánh tan, tránh hiện tượng vón cục làm ảnh hưởng xấu ựến chất lượng vacxin.
Khi có kết quả hấp vô trùng keo phèn với nước sinh lý, cho canh trùng vào, khuấy 30 phút bằng máy khuấy từ cho hỗn hợp ựược ựồng nhất, tạo ựiều kiện cho kháng nguyên hấp phụ lên bề mặt keo phèn. Sau ựó lấy mẫu kiểm tra vô trùng, sản phẩm ựược bảo quản trong kho lạnh từ 2 Ờ 8oC ựến khi ựã có kết quả vô trùng rồi tiến hành ra chai.
3.5.7. Phương pháp kiểm nghiệm vacxin
3.5.7.1. Phương pháp lấy mẫu kiểm nghiệm
Mẫu kiểm nghiệm là các ựơn vị sản phẩm ựược lấy từ các lô vacxin ựể tiến hành kiểm nghiệm trước khi xuất xưởng và lưu giữ trong thời gian bảo quản của vacxin.
Mẫu phải có tắnh ựại diện, lấy ngẫu nhiên theo tỷ lệ quy ựịnh và ựược bảo quản trong ựiều kiện phù hợp, an toàn, khi ựến phòng kiểm nghiệm phải ựược tiến hành ngay các thủ Tục kiểm nghiệm trong thời gian ngắn nhất.
Lấy mẫu theo tiêu chuẩn ngành 10 TCN 160 Ờ 92 ỘVacxin thú y - Quy trình lấy mẫu và sử dụng mẫu trong kiểm nghiệmỢ, mẫu ựược lấy theo lô vacxin
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 45 với tỷ lệ như sau:
10% sản phẩm (ắt nhất là 5) ựối với lô dưới 100 sản phẩm. 10% sản phẩm ựối với lô 100 ựến dưới 500 sản phẩm.
2% sản phẩm ựối với lô từ 500 sản phẩm trở lên (nhiều nhất là 20 sản phẩm). Mẫu ựược chia làm 3 nhóm:
Nhóm 1: từ 3 sản phẩm trở lên dùng ựể kiểm tra thuần khiết. Nhóm 2: từ 3 sản phẩm trở lên dùng ựể kiểm tra các chỉ tiêu khác. Nhóm 3: 2 sản phẩm ựể lưu giữ.
3.5.7.2. Phương pháp kiểm tra vô trùng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Mỗi lô vacxin ựược kiểm tra trên các môi trường cơ bản sau: + 2 ống thạch máu
+ 2 ống thạch thường + 2 ống nước thịt
+ 2 ống nước thịt gan yếm khắ + 2 ống thạch nấm
+ 2 lọ nước thịt dinh dưỡng 50ml
- Lượng vacxin cấy kiểm tra vào mỗi ống môi trường 0,2ml.
Vacxin Tụ huyết trùng gia cầm ựược kiểm tra trên các môi trường theo hai bước sau:
+ Bước 1: Cấy mẫu vào 2 lọ nước thịt dinh dưỡng 50ml, theo dõi ở 37oC trong 3 ngày.
+ Bước 2: Cấy chuyển từ 2 lọ nước thịt dinh dưỡng trên sang 2 ống thạch máu, 2 ống thạch thường, 2 ống nước thịt, 2 ống nước thịt gan yếm khắ và 2 ống thạch nấm, theo dõi ở 37oC trong 7 ngày. Riêng 2 ống thạch nấm ựể ở nhiệt ựộ phòng 25 - 30oC.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 46 Lô vacxin ựược ựánh giá là ựạt chỉ tiêu vô trùng khi không có bất cứ một loại vi sinh vật tạp nào mọc trên các môi trường trong thời gian theo dõi.
3.5.7.3. Phương pháp kiểm tra an toàn
để tiến hành kiểm tra an toàn của vacxin vô hoạt Tụ huyết trùng gia cầm, chúng tôi tiến hành như sau:
Mỗi lô vacxin sử dụng hai gà có trọng lượng 1,0 Ờ 2,0 kg chưa ựược tiêm vacxin Tụ huyết trùng gia cầm, mỗi gà tiêm dưới da 2 ml vacxin và theo dõi trong 10 ngày.
Nội dung theo dõi ựược quy ựịnh với những tiêu chắ: sốc vacxin, kém ăn, viêm, sưng cục bộ nơi tiêm và các phản ứng phụ khácẦ
đánh giá kết quả: sau 10 ngày theo dõi, hai gà phải sống khỏe mạnh, không có phản ứng hoặc phản ứng nằm trong phạm vi cho phép và không có con nào chết thì lô vacxin mới ựạt tiêu chuẩn.
3.5.7.4. Phương pháp kiểm tra hiệu lực
Tiêm miễn dịch cho 4 gà (1,0 Ờ 2,0kg) mỗi con một liều vacxin quy ựịnh. Sau 21 ngày gà ựược miễn dịch cùng với 2 gà ựối chứng cùng nguồn gốc và lứa tuổi ựược thử thách với vi khuẩn Tụ huyết trùng gà cường ựộc tương ứng, liều 1 MLD vào dưới da. Theo dõi trong 10 ngày, vacxin ựược gọi là ựạt tiêu chuẩn hiệu lực nếu:
Gà ựối chứng chết hết trong khi gà miễn dịch sống ắt nhất 2 con. Gà ựối chứng chết một, gà miễn dịch sống tất cả.
3.5.8. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả nghiên cứu thu ựược ựược xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học và phần mềm excel.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 47
Phần IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Xác ựịnh môi trường thạch dùng ựểựếm số lượng vi khuẩn Pasteurella multocida multocida
Việc xác ựịnh chắnh xác số lượng vi khuẩn trong mỗi ml canh trùng có ý nghĩa quan trọng trong quá trình sản xuất vacxin. Xác ựịnh không chắnh xác sẽ làm ảnh hưởng ựến hiệu quả kinh tế nếu như xác ựịnh số lượng vi khuẩn ắt hơn thực tế, hoặc làm giảm số vi khuẩn trong mỗi ml vacxin nếu như xác ựịnh số lượng vi khuẩn nhiều hơn thực tế.
Chúng tôi sử dụng phương pháp ựếm số ựể xác ựịnh số lượng vi khuẩn. Vì vậy, ựể có kết quả chắnh xác về số lượng vi khuẩn trong quá trình sản xuất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tắnh chất mọc của vi khuẩn Tụ huyết trùng gia cầm trên hai loại môi trường là Nutrient Agar (NA) và Blood Agar (BA) có bổ sung máu với hàm lượng khác nhau, kết quả ựược trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả xác ựịnh môi trường thạch dùng ựểựếm số lượng vi khuẩn Pasteurella multocida
Số lượng khuẩn lạc (109CFU/ml) Nồng ựộ 10-8 Nồng ựộ 10-7 đợt thắ nghiệm Tỷ lệ máu bổ sung (%) NA BA NA BA 0 0 1,5ổ0,1 1,3 12,3ổ0,1 6 23,3ổ0,2 28,3ổ0,3 187,7ổ0,2 257,9ổ0,2 8 24,4ổ0,1 31,6ổ0,2 241,6ổ0,1 289,1ổ0,3 1 10 23,2ổ0,1 30,4ổ0,3 246,5ổ0,2 294,8ổ0,2 0 0 2,8ổ0,2 0 14,4ổ0,3 6 26,7ổ0,1 27,3ổ0,3 208,7ổ0,1 268,8ổ0,1 8 26,1ổ0,2 33,8ổ0,2 247,1ổ0,2 310,5ổ0,2 2 10 27,3ổ0,1 34,4ổ0,3 251,3ổ0,3 313,1ổ0,3 0 0 2,7ổ0,3 0 13,8ổ0,1 6 25,6ổ0,2 25,9ổ0,1 179,4ổ0,2 255,5ổ0,2 8 26,1ổ0,1 31,3ổ0,2 271,7 300,4ổ0,1 3 10 26,4ổ0,2 31,5ổ0,3 269,1ổ0,3 302,5ổ0,2
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 48
Hình 4.1. Sự phát triển của vi khuẩn Pasteurella multocida trên môi trường thạch NA (trái) và BA (phải) bổ sung 8% máu bò.
Bảng 4.1 cho thấy vi khuẩn P. multocida không mọc hoặc mọc rất kém trên cả hai môi trường thạch NA và BA không bổ sung máu. Tuy nhiên, vi khuẩn mọc tốt ở môi trường có bổ sung máu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tại nồng ựộ 10-8 trên cả hai môi trường thạch NA và thạch BA có bổ sung máu không có sự chênh lệch về số lượng khuẩn lạc ở các nồng ựộ máu khác