III. í NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
3.3.2. Nghiờn cứu bệnh giun T.sui sở lợn nhiễm tự nhiờn
- Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm giun T. suis giữa lợn tiờu chảy và lợn khỏe. - Tỷ lệ lợn cú biểu hiện lõm sàng chủ yếu của bệnh giun T. suis ở một số địa phƣơng.
- Tỷ lệ lợn mắc bệnh giun T. suis cú bệnh tớch đại thể ở ruột già.
2.3.4. Nghiờn cứu biện phỏp phũng trị bệnh giun T. suis cho lợn
2.3.4.1. Xỏc định hiệu lực và độ an toàn của một số thuốc tẩy giun T. suis
- Hiệu lực và độ an toàn của thuốc tẩy giun T. suis cho lợn thớ nghiệm. - Hiệu lực của thuốc tẩy giun T. suis cho lợn trờn thực địa.
- Độ an toàn của thuốc tẩy giun T. suis cho lợn trờn thực địa.
2.3.4.2. Đề xuất và ỏp dụng quy trỡnh phũng trị bệnh giun T. suis cho lợn
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.4.1. Phƣơng phỏp xỏc định thành phần loài giun T.suis ký sinh ở lợn
2.4.1.1. Phương phỏp mổ khỏm lợn
Áp dụng phƣơng phỏp mổ khỏm phi toàn diện cơ quan tiờu hoỏ của Skrjabin và cs (1928) [44]. Thu lƣợm giun T. suis trong chất chứa ruột già bằng phƣơng phỏp lắng cặn Bendek (1943), thu lƣợm hết giun cũn bỏm trờn niờm mạc.
Số húa bởi trung tõm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Mẫu giun T. suis thu đƣợc ở mỗi lợn đều đƣợc bảo quản ở lọ riờng. Trƣớc hết, để chỳng chết trong nƣớc sạch, sau đú đƣa vào bảo quản trong dung dịch Barbagallo. Mỗi lọ đều cú nhón ghi số thứ tự, tuổi, địa điểm, thời gian mổ khỏm, nơi giun ký sinh, số lƣợng giun ký sinh /con, tờn ngƣời mổ khỏm.
2.4.1.2. Phương phỏp xỏc định thành phần loài giun T. suis
Định danh loài giun T. suis theo khúa định loài của Skrjabin và cs
(1928) [44], Nguyễn Thị Lờ (1996) [22], căn cứ vào hỡnh thỏi, kớch thƣớc và cấu tạo của cỏc loài để xỏc định.
2.4.2. Phƣơng phỏp nghiờn cứu đặc điểm dịch tễ bệnh giun T. suis ở lợn tại tỉnh Bắc Kạn tại tỉnh Bắc Kạn
2.4.2.1. Phương phỏp điều tra cụng tỏc phũng chống bệnh ký sinh trựng núi chung, bệnh giun T. suis núi riờng cho lợn
- Trực tiếp quan sỏt
- Kết hợp phỏng vấn và phỏt phiếu điều tra
2.4.2.2. Quy định những yếu tố cần xỏc định liờn quan đến tỡnh hỡnh nhiễm giun T. suis ở lợn
- Tuổi lợn: Chia thành 4 lứa tuổi. ≤ 2 thỏng
> 2 - 4 thỏng > 4 - 6 thỏng > 6 thỏng
- Loại thức ăn chăn nuụi: Nghiờn cứu với 3 loại thức ăn chăn nuụi + Thức ăn truyền thống: Hộ gia đỡnh chăn nuụi với số lƣợng ớt, thức ăn cho lợn chủ yếu là cỏc phế phụ phẩm tận dụng của ngành trồng trọt (khoai, sắn, bột ngụ, cỏm xỏt, rau xanh).
+ Thức ăn tổng hợp: Chăn nuụi với số lƣợng lớn, thức ăn cho lợn là thức ăn tổng hợp, hệ thống chuồng trại khỏ hiện đại, điều kiện vệ sinh thỳ y tốt.
Số húa bởi trung tõm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
+ Thức ăn bỏn cụng nghiệp: Chăn nuụi với số lƣợng khỏ lớn, thức ăn cho lợn là thức ăn hỗn hợp, hệ thống chuồng trại sạch sẽ, điều kiện vệ sinh thỳ y tƣơng đối tốt.
- Mựa vụ: Theo dừi ở 4 mựa + Xuõn : từ thỏng 2 - 4 + Hạ : từ thỏng 5 - 7 + Thu : từ thỏng 8 - 10
+ Đụng : từ thỏng 11 đến thỏng 1 năm sau
2.4.2.3. Phương phỏp thu thập, xột nghiệm mẫu, thu nhận trứng giun T. suis
- Bố trớ thu thập mẫu theo phƣơng phỏp lấy mẫu phõn tầng. Mỗi huyện chọn 5 xó (phƣờng), mỗi xó (phƣờng) chọn 5 thụn (bản) để lấy mẫu.
Mẫu đƣợc thu thập ngẫu nhiờn tại cỏc nụng hộ, trang trại chăn nuụi lợn tại tỉnh Bắc Kạn.
Cỏc loại mẫu đƣợc xột nghiệm trong ngày hoặc xột nghiệm sau khi bảo quản theo quy trỡnh bảo quản mẫu trong nghiờn cứu ký sinh trựng học.
- Xột nghiệm mẫu bằng phƣơng phỏp Fulleborn.
Cỏch tiến hành: Lấy khoảng 5 - 10 gam phõn của con vật cần xột nghiệm cho vào cốc thủy tinh. Cho nƣớc muối bóo hũa vào cốc với lƣợng thể tớch gấp 10 lần khối lƣợng phõn. Dựng đũa thủy tinh khuấy nỏt phõn và lọc qua lƣới lọc bỏ phần cặn bó, dung dịch lọc đƣợc đổ vào cỏc lọ nhỏ cho đầy đến miệng. Đậy phiến kớnh lờn trờn ống cho tiếp xỳc với mặt nƣớc, để khoảng 15 phỳt rồi lấy phiến kớnh ra soi dƣới kớnh hiển vi tỡm trứng giun.
- Thu thập trứng bằng phƣơng phỏp Darling.
Cỏch tiến hành: Lấy khoảng 5 - 10 gam phõn của con vật cần xột nghiệm cho vào cốc thủy tinh, cho một lƣợng nƣớc sạch gấp 10 lần thể tớch khối lƣợng phõn vào rồi dựng đũa thủy tinh khuấy đều và lọc qua lƣới lọc. Phần cặn bó bỏ đi, dung dịch lọc đƣợc cho vào cỏc ống ly tõm và ly tõm với
Số húa bởi trung tõm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tốc độ 3000 vũng /phỳt trong thời gian từ 3 - 5 phỳt. Sau đú, bỏ lớp nƣớc phớa trờn, giữ lại cặn trong cỏc ống ly tõm, cho tiếp nƣớc muối bóo hũa vào cỏc ống ly tõm, đậy nắp miệng ống và lắc đều cho cặn hũa đều trong dung dịch, tiến hành ly tõm lần hai với tốc độ và thời gian nhƣ trờn. Dựng vũng thộp vớt lớp vỏng nổi lờn trờn bề mặt, cho vào cốc thủy tinh đựng nƣớc sạch.
2.4.2.4. Phương phỏp xỏc định tỷ lệ và cường độ nhiễm giun T. suis
- Phương phỏp xỏc định tỷ lệ nhiễm giun T. suis
Mẫu phõn đƣợc xột nghiệm bằng phƣơng phỏp Fulleborn với dung dịch muối NaCl bóo hoà. Mẫu cặn nền chuồng, mẫu đất bề mặt xung quanh chuồng và vƣờn trồng cõy thức ăn cho lợn đƣợc xột nghiệm bằng phƣơng phỏp Fulleborn, tỡm trứng giun túc dƣới kớnh hiển vi, độ phúng đại 100 lần. Những mẫu cú trứng giun T. suis đƣợc đỏnh giỏ là cú nhiễm,
ngƣợc lại là khụng nhiễm.
- Phương phỏp xỏc định cường độ nhiễm giun T. suis
Xỏc định cƣờng độ nhiễm giun T. suis bằng phƣơng phỏp đếm trứng
Mc. Master.
Quy định cỏc cƣờng độ nhiễm nhẹ, trung bỡnh và nặng nhƣ sau: Nhiễm nhẹ: ≤ 500 trứng /g phõn
Nhiễm trung bỡnh: > 500 - 1000 trứng /g phõn Nhiễm nặng: > 1000 trứng /g phõn
2.4.3. Phƣơng phỏp nghiờn cứu sự ụ nhiễm trứng giun T. suis ở ngoại cảnh
2.4.3.1. Phương phỏp nghiờn cứu sự ụ nhiễm trứng giun T. suis ở nền chuồng, xung quanh chuồng nuụi và vườn bói trồng cõy thức ăn cho lợn
* Phương phỏp thu thập mẫu
- Mẫu cặn nền chuồng: Tại mỗi ụ chuồng lấy mẫu cặn ở 4 gúc và ở
giữa ụ chuồng, trộn đều đƣợc một mẫu xột nghiệm (khoảng 100 g /mẫu). Mỗi mẫu đƣợc để riờng trong tỳi nilon cú ghi nhón: Tờn chủ hộ, địa điểm, thời gian lấy mẫu. Mẫu đƣợc xột nghiệm ngay trong ngày.
Số húa bởi trung tõm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Mẫu đất bề mặt xung quanh chuồng nuụi: Trong khoảng bỏn kớnh 5 m
xung quanh chuồng lợn, cứ 10 - 15 m2 lấy một mẫu đất bề mặt. Một mẫu cú khối lƣợng khoảng 100 g, đƣợc trộn đều bởi 4 mẫu ở 4 gúc và 1 mẫu ở giữa. Mỗi mẫu đƣợc để riờng trong tỳi nilon cú ghi nhón: Tờn chủ hộ, địa điểm, thời gian lấy mẫu.
- Mẫu đất ở vườn, bói trồng cõy thức ăn cho lợn: Cứ 10 - 15 m2 lấy một mẫu đất bề mặt. Một mẫu cú khối lƣợng khoảng 100 g, đƣợc phối hợp bởi 4 mẫu ở 4 gúc và 1 mẫu ở giữa. Mỗi mẫu đƣợc để riờng trong tỳi nilon cú ghi nhón: Tờn chủ hộ, địa điểm, thời gian lấy mẫu.
* Phương phỏp xột nghiệm mẫu
Áp dụng phƣơng phỏp Fulleborn và phƣơng phỏp Gefter để phỏt hiện trứng giun T. suis.
Phƣơng phỏp Gefter: Là phƣơng phỏp đƣợc sử dụng để xột nghiệm trứng giun trong đất.
Cỏch làm: Cho NaOH 5 % vào mẫu đất (tỷ lệ 1,5 NaOH : 1 đất), đƣa vào mỏy lắc 3 - 5 phỳt để tỏch trứng giun ra khỏi đất, sau đú đƣa vào mỏy ly tõm tốc độ 3000 vũng / phỳt, trong 2 - 3 phỳt. Bỏ phần nƣớc phớa trờn, giữ phần cặn cú trứng giun T. suis, cho dung dịch NaNO3 bóo hũa vào, trứng giun
T. suis cú tỷ trọng nhỏ hơn sẽ nổi lờn trờn, dựng vũng thộp vớt trứng hoặc
dựng lam kớnh cho tiếp xỳc với bề mặt của dung dịch ta sẽ thu đƣợc trứng giun T. suis.
2.4.3.2. Phương phỏp nghiờn cứu sự phỏt triển của trứng giun T. suis và khả năng sống của trứng giun T. suis cảm nhiễm ở ngoại cảnh
Thu nhận trứng giun T. suis từ những mẫu phõn của lợn đó đƣợc xỏc
định là chỉ nhiễm giun T. suis và nhiễm ở cƣờng độ nặng.
Số húa bởi trung tõm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Nuụi trứng giun T. suis trong những mẫu phõn ở phũng thớ nghiệm.
Mỗi mẫu để trong một khay nhựa kớch thƣớc 30 x 20 cm. Trong đú, mỗi mựa theo dừi 5 mẫu. Mỗi ngày lấy 3 - 5 gam phõn /mẫu, xột nghiệm bằng phƣơng phỏp Fulleborn để kiểm tra sự phỏt triển của trứng để xỏc định thời gian trứng phỏt triển thành trứng cú sức gõy nhiễm. Đếm số trứng /3 vi trƣờng kớnh hiển vi và đếm số trứng cú sức gõy bệnh, từ đú xỏc định đƣợc tỷ lệ và thời gian trứng phỏt triển thành trứng cú sức gõy nhiễm. Mụ tả sự phỏt triển của trứng trong quỏ trỡnh theo dừi.
Do thời gian sống của trứng giun T. suis cú sức gõy bệnh cú thể kộo dài nờn khi tất cả cỏc trứng đó phỏt triển thành trứng cú sức gõy bệnh thỡ cứ 5 ngày xột nghiệm một lần để xỏc định khả năng sống của trứng giun T. suis
theo thời gian.
Cỏch xột nghiệm: Mỗi lần lấy khoảng 5 gam phõn /mẫu, xột nghiệm bằng phƣơng phỏp Fulleborn, đếm số trứng cú sức gõy bệnh /3 vi trƣờng và đếm số trứng chết. Từ đú, xỏc định đƣợc tỷ lệ trứng giun T. suis chết theo thời gian.
2.4.4. Phƣơng phỏp nghiờn cứu bệnh giun T. suis 2.4.4.1. Phương phỏp gõy nhiễm giun T. suis cho lợn 2.4.4.1. Phương phỏp gõy nhiễm giun T. suis cho lợn
Gõy nhiễm giun T. suis cho 5 lợn 1 thỏng tuổi (cú 5 lợn đối chứng
khụng gõy nhiễm). Cả 5 lợn trƣớc khi gõy nhiễm đƣợc nuụi cỏch ly tại chuồng, hàng ngày đƣợc xột nghiệm phõn và theo dừi trƣớc khi gõy nhiễm để đảm bảo những lợn đú là khoẻ mạnh, khụng nhiễm giun sỏn, khụng mắc bệnh.
* Phương phỏp thu nhận trứng giun T. suis cảm nhiễm
Nuụi trứng giun T. suis phỏt triển trong phõn thành trứng cảm nhiễm,
Số húa bởi trung tõm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
* Phương phỏp tớnh số lượng trứng giun T. suis cảm nhiễm
Trứng giun T. suis cảm nhiễm sau khi thu nhận đƣợc cho vào cốc thuỷ tinh cú chứa 60 ml nƣớc sạch, nhẹ nhàng khuấy đều nƣớc trong cốc. Dựng cụng tơ hỳt hỳt 3 lần, mỗi lần 1 ml, đếm và xỏc định số trứng giun T. suis cảm nhiễm trung bỡnh trong 1 ml. Từ đú xỏc định đƣợc liều gõy nhiễm cho lợn tƣơng ứng với số ml nƣớc chứa trứng T. suis cảm nhiễm. Gõy nhiễm trứng
giun T. suis cảm nhiễm cho lợn qua đƣờng miệng.
Mỗi lợn sau gõy nhiễm đƣợc bố trớ nuụi nhốt trong 1 ụ chuồng, điều kiện vệ sinh thỳ y tốt và chăm súc nuụi dƣỡng tốt.
Hàng ngày lấy mẫu phõn tƣơi của lợn xột nghiệm, xỏc định thời gian hoàn thành vũng đời (là thời gian bắt đầu xuất hiện trứng giun T. suis); đếm
số trứng thải ra mỗi ngày, theo dừi cỏc biểu hiện lõm sàng của lợn gõy nhiễm. Cũng xột nghiệm phõn của lợn đối chứng nhƣ trờn.
Mổ khỏm lợn chết (ngay sau khi chết) và lợn bệnh sống (60 ngày sau gõy nhiễm) để kiểm tra bệnh tớch đại thể và lấy bệnh phẩm làm tiờu bản vi thể.
2.4.4.2. Phương phỏp theo dừi cỏc biểu hiện lõm sàng bệnh giun T. suis ở lợn gõy nhiễm
Phƣơng phỏp chủ yếu là quan sỏt những biểu hiện của lợn: Thể trạng, niờm mạc, phõn, ăn uống, vận động.
2.4.4.3. Phương phỏp xột nghiệm mỏu để xỏc định một số chỉ số huyết học của lợn trước và sau khi gõy nhiễm
* Phương phỏp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Lấy mẫu mỏu của lợn trƣớc khi gõy nhiễm và sau khi gõy nhiễm trứng giun T. suis 40 ngày. Mỗi mẫu mỏu đƣợc đƣa vào một tube (1 ml /tube) cú chất chống đụng mỏu. Trờn mỗi tube ghi thời gian lấy mẫu, số ký hiệu lợn. Mẫu mỏu đƣợc bảo quản trong hộp bảo ụn và đƣợc xột nghiệm ngay trong ngày.
Số húa bởi trung tõm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
* Phương phỏp xột nghiệm
Số lƣợng hồng cầu, bạch cầu, hàm lƣợng huyết sắc tố và cụng thức bạch cầu đƣợc xỏc định bằng mỏy Cellta - Mek - 6420k - Nihon Kohden.
* Mẫu mỏu lợn bệnh và lợn khoẻ ở thực địa cũng được thu thập và xột nghiệm như trờn.
2.4.4.4. Phương phỏp xỏc định bệnh tớch đại thể
- Mổ khỏm lợn mắc bệnh giun T. suis sau khi gõy nhiễm thực nghiệm, quan sỏt bằng mắt thƣờng và kớnh lỳp cỏc phần của ruột già. Chụp ảnh vựng cú bệnh tớch điển hỡnh.
- Lợn bị bệnh ở thực địa cũng đƣợc mổ khỏm và xỏc định nhƣ trờn.
2.4.4.5. Phương phỏp xỏc định những biến đổi bệnh lý vi thể ở cơ quan tiờu hoỏ lợn mắc bệnh giun T. suis do gõy nhiễm
Mẫu bệnh phẩm là những phần ruột già của lợn gõy nhiễm giun T. suis, cố định trong dung dịch formol 10 %.
Tiờu bản vi thể đƣợc làm theo quy trỡnh tẩm đỳc Parafin, nhuộm Hematoxillin - Eosin (H.E). Đọc kết quả dƣới kớnh hiển vi quang học, độ phúng đại tối đa 150 - 600 lần. Cỏc bƣớc nhƣ sau:
+ Lấy cỏc đoạn ruột cú bệnh tớch, cố định trong dung dịch Formol 10 %. Sau 15 ngày lấy mẫu bệnh phẩm trong Formol 10 % ra cắt mỏng 2 - 3 mm, rửa dƣới vũi nƣớc chảy trong 2 - 3 giờ.
Chuyển ngõm trong cồn 700
với thời gian 2 - 3 giờ. Ngõm trong cồn 900 trong 2 - 3 giờ.
Ngõm trong cồn tuyệt đối (1000) 2 - 3 giờ. Ngõm trong xylen 1 trong 2 - 3 giờ.
Ngõm sang xylen 2 trong 2 - 3 giờ. Ngõm tẩm nến 3 lần, mỗi lần 2 - 3 giờ. Đỳc khuụn.
Số húa bởi trung tõm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ + Cắt tiờu bản:
Cắt gọt khối block nến vuụng, mặt cắt bằng phẳng, để trờn mặt khay đỏ lạnh khoảng 5 - 10 phỳt.
Đặt mặt khối block nến song song với mộp lƣỡi dao, cắt chiều dày lỏt cắt 3 - 5 àm.
Chọn lỏt cắt tiờu bản phẳng thả vào nồi chƣng cất nhiệt độ nƣớc 30 - 35o
C; dựng lam kớnh chọn lỏt cắt gión phẳng, khụng nhăn nheo vớt, dựng nghiờng, để vào tủ ấm 37o
C cho khụ. + Nhuộm H.E:
Để cỏc tiờu bản vào tủ ấm 60oC trong vũng 30 phỳt cho nến tan chảy. Lấy ra tẩy nến trong xylen 3 lần, mỗi lần 3 - 5 phỳt.
Ngõm trong cồn tuyệt đối 3 - 5 phỳt. Ngõm sang cồn 900
3 - 5 phỳt. Ngõm sang cồn 700
3 - 5 phỳt. Rửa dƣới vũi nƣớc chảy 3 - 5 phỳt.
Ngõm trong thuốc nhuộm Hematoxilin 1 - 2 phỳt. Rửa dƣới vũi nƣớc chảy 3 - 5 phỳt.
Ngõm trong thuốc nhuộm Eosin 60 - 90 giõy.
Rửa dƣới vũi nƣớc chảy 2 - 3 phỳt, chỳ ý màu Eosin. Để khụ trong nhiệt độ phũng (hoặc ngõm trong cồn 900
và cồn tuyệt đối), chuyển sang xylen 2 lần (mỗi lần 2 - 3 phỳt), gắn lamen bằng Balm canada. Để khụ, soi kớnh.
+ Soi kiểm tra dƣới kớnh hiển vi quang học độ phúng đại 150 - 600 lần.
2.4.4.6. Phương phỏp xỏc định tỷ lệ và cường độ nhiễm giun T. suis ở lợn bỡnh thường và lợn tiờu chảy tại cỏc địa phương
- Thu thập mẫu phõn lợn khoẻ và lợn tiờu chảy. Những lợn này tƣơng đối đồng đều về lứa tuổi, cựng mựa vụ, ở cựng địa phƣơng.
Số húa bởi trung tõm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Dựng phƣơng phỏp Fulleborn để xỏc định tỷ lệ nhiễm, dựng phƣơng phỏp đếm trứng Mc. Master để xỏc định cƣờng độ nhiễm giun T. suis. Từ đú
xỏc định đƣợc tỷ lệ lợn khoẻ và lợn tiờu chảy bị nhiễm giun T. suis. Phõn tớch và đỏnh giỏ đƣợc tỏc động của giun T. suis trong hội chứng tiờu chảy ở lợn.
2.4.4.7. Phương phỏp xỏc định triệu chứng lõm sàng chủ yếu của lợn bị bệnh giun T. suis ở cỏc địa phương
Trong quỏ trỡnh xột nghiệm phõn, phỏt hiện những lợn nhiễm giun T. suis.