III. í NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
2.4.4.Phƣơng phỏp nghiờn cứu bệnh giun T.suis
2.4.4.1. Phương phỏp gõy nhiễm giun T. suis cho lợn
Gõy nhiễm giun T. suis cho 5 lợn 1 thỏng tuổi (cú 5 lợn đối chứng
khụng gõy nhiễm). Cả 5 lợn trƣớc khi gõy nhiễm đƣợc nuụi cỏch ly tại chuồng, hàng ngày đƣợc xột nghiệm phõn và theo dừi trƣớc khi gõy nhiễm để đảm bảo những lợn đú là khoẻ mạnh, khụng nhiễm giun sỏn, khụng mắc bệnh.
* Phương phỏp thu nhận trứng giun T. suis cảm nhiễm
Nuụi trứng giun T. suis phỏt triển trong phõn thành trứng cảm nhiễm,
Số húa bởi trung tõm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
* Phương phỏp tớnh số lượng trứng giun T. suis cảm nhiễm
Trứng giun T. suis cảm nhiễm sau khi thu nhận đƣợc cho vào cốc thuỷ tinh cú chứa 60 ml nƣớc sạch, nhẹ nhàng khuấy đều nƣớc trong cốc. Dựng cụng tơ hỳt hỳt 3 lần, mỗi lần 1 ml, đếm và xỏc định số trứng giun T. suis cảm nhiễm trung bỡnh trong 1 ml. Từ đú xỏc định đƣợc liều gõy nhiễm cho lợn tƣơng ứng với số ml nƣớc chứa trứng T. suis cảm nhiễm. Gõy nhiễm trứng
giun T. suis cảm nhiễm cho lợn qua đƣờng miệng.
Mỗi lợn sau gõy nhiễm đƣợc bố trớ nuụi nhốt trong 1 ụ chuồng, điều kiện vệ sinh thỳ y tốt và chăm súc nuụi dƣỡng tốt.
Hàng ngày lấy mẫu phõn tƣơi của lợn xột nghiệm, xỏc định thời gian hoàn thành vũng đời (là thời gian bắt đầu xuất hiện trứng giun T. suis); đếm
số trứng thải ra mỗi ngày, theo dừi cỏc biểu hiện lõm sàng của lợn gõy nhiễm. Cũng xột nghiệm phõn của lợn đối chứng nhƣ trờn.
Mổ khỏm lợn chết (ngay sau khi chết) và lợn bệnh sống (60 ngày sau gõy nhiễm) để kiểm tra bệnh tớch đại thể và lấy bệnh phẩm làm tiờu bản vi thể.
2.4.4.2. Phương phỏp theo dừi cỏc biểu hiện lõm sàng bệnh giun T. suis ở lợn gõy nhiễm
Phƣơng phỏp chủ yếu là quan sỏt những biểu hiện của lợn: Thể trạng, niờm mạc, phõn, ăn uống, vận động.
2.4.4.3. Phương phỏp xột nghiệm mỏu để xỏc định một số chỉ số huyết học của lợn trước và sau khi gõy nhiễm
* Phương phỏp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Lấy mẫu mỏu của lợn trƣớc khi gõy nhiễm và sau khi gõy nhiễm trứng giun T. suis 40 ngày. Mỗi mẫu mỏu đƣợc đƣa vào một tube (1 ml /tube) cú chất chống đụng mỏu. Trờn mỗi tube ghi thời gian lấy mẫu, số ký hiệu lợn. Mẫu mỏu đƣợc bảo quản trong hộp bảo ụn và đƣợc xột nghiệm ngay trong ngày.
Số húa bởi trung tõm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
* Phương phỏp xột nghiệm
Số lƣợng hồng cầu, bạch cầu, hàm lƣợng huyết sắc tố và cụng thức bạch cầu đƣợc xỏc định bằng mỏy Cellta - Mek - 6420k - Nihon Kohden.
* Mẫu mỏu lợn bệnh và lợn khoẻ ở thực địa cũng được thu thập và xột nghiệm như trờn.
2.4.4.4. Phương phỏp xỏc định bệnh tớch đại thể
- Mổ khỏm lợn mắc bệnh giun T. suis sau khi gõy nhiễm thực nghiệm, quan sỏt bằng mắt thƣờng và kớnh lỳp cỏc phần của ruột già. Chụp ảnh vựng cú bệnh tớch điển hỡnh.
- Lợn bị bệnh ở thực địa cũng đƣợc mổ khỏm và xỏc định nhƣ trờn.
2.4.4.5. Phương phỏp xỏc định những biến đổi bệnh lý vi thể ở cơ quan tiờu hoỏ lợn mắc bệnh giun T. suis do gõy nhiễm
Mẫu bệnh phẩm là những phần ruột già của lợn gõy nhiễm giun T. suis, cố định trong dung dịch formol 10 %.
Tiờu bản vi thể đƣợc làm theo quy trỡnh tẩm đỳc Parafin, nhuộm Hematoxillin - Eosin (H.E). Đọc kết quả dƣới kớnh hiển vi quang học, độ phúng đại tối đa 150 - 600 lần. Cỏc bƣớc nhƣ sau:
+ Lấy cỏc đoạn ruột cú bệnh tớch, cố định trong dung dịch Formol 10 %. Sau 15 ngày lấy mẫu bệnh phẩm trong Formol 10 % ra cắt mỏng 2 - 3 mm, rửa dƣới vũi nƣớc chảy trong 2 - 3 giờ.
Chuyển ngõm trong cồn 700
với thời gian 2 - 3 giờ. Ngõm trong cồn 900 trong 2 - 3 giờ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ngõm trong cồn tuyệt đối (1000) 2 - 3 giờ. Ngõm trong xylen 1 trong 2 - 3 giờ.
Ngõm sang xylen 2 trong 2 - 3 giờ. Ngõm tẩm nến 3 lần, mỗi lần 2 - 3 giờ. Đỳc khuụn.
Số húa bởi trung tõm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ + Cắt tiờu bản:
Cắt gọt khối block nến vuụng, mặt cắt bằng phẳng, để trờn mặt khay đỏ lạnh khoảng 5 - 10 phỳt.
Đặt mặt khối block nến song song với mộp lƣỡi dao, cắt chiều dày lỏt cắt 3 - 5 àm.
Chọn lỏt cắt tiờu bản phẳng thả vào nồi chƣng cất nhiệt độ nƣớc 30 - 35o
C; dựng lam kớnh chọn lỏt cắt gión phẳng, khụng nhăn nheo vớt, dựng nghiờng, để vào tủ ấm 37o
C cho khụ. + Nhuộm H.E:
Để cỏc tiờu bản vào tủ ấm 60oC trong vũng 30 phỳt cho nến tan chảy. Lấy ra tẩy nến trong xylen 3 lần, mỗi lần 3 - 5 phỳt.
Ngõm trong cồn tuyệt đối 3 - 5 phỳt. Ngõm sang cồn 900
3 - 5 phỳt. Ngõm sang cồn 700
3 - 5 phỳt. Rửa dƣới vũi nƣớc chảy 3 - 5 phỳt.
Ngõm trong thuốc nhuộm Hematoxilin 1 - 2 phỳt. Rửa dƣới vũi nƣớc chảy 3 - 5 phỳt.
Ngõm trong thuốc nhuộm Eosin 60 - 90 giõy.
Rửa dƣới vũi nƣớc chảy 2 - 3 phỳt, chỳ ý màu Eosin. Để khụ trong nhiệt độ phũng (hoặc ngõm trong cồn 900
và cồn tuyệt đối), chuyển sang xylen 2 lần (mỗi lần 2 - 3 phỳt), gắn lamen bằng Balm canada. Để khụ, soi kớnh.
+ Soi kiểm tra dƣới kớnh hiển vi quang học độ phúng đại 150 - 600 lần.
2.4.4.6. Phương phỏp xỏc định tỷ lệ và cường độ nhiễm giun T. suis ở lợn bỡnh thường và lợn tiờu chảy tại cỏc địa phương
- Thu thập mẫu phõn lợn khoẻ và lợn tiờu chảy. Những lợn này tƣơng đối đồng đều về lứa tuổi, cựng mựa vụ, ở cựng địa phƣơng.
Số húa bởi trung tõm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Dựng phƣơng phỏp Fulleborn để xỏc định tỷ lệ nhiễm, dựng phƣơng phỏp đếm trứng Mc. Master để xỏc định cƣờng độ nhiễm giun T. suis. Từ đú
xỏc định đƣợc tỷ lệ lợn khoẻ và lợn tiờu chảy bị nhiễm giun T. suis. Phõn tớch và đỏnh giỏ đƣợc tỏc động của giun T. suis trong hội chứng tiờu chảy ở lợn.
2.4.4.7. Phương phỏp xỏc định triệu chứng lõm sàng chủ yếu của lợn bị bệnh giun T. suis ở cỏc địa phương
Trong quỏ trỡnh xột nghiệm phõn, phỏt hiện những lợn nhiễm giun T. suis. Chọn ra những lợn chỉ nhiễm giun T. suis mà khụng nhiễm bất kỳ loại giun sỏn và bệnh truyền nhiễm nào khỏc, theo dừi cỏc biểu hiện lõm sàng chớnh của những lợn này. Sử dụng phƣơng phỏp đo thõn nhiệt bằng nhiệt kế, quan sỏt thể trạng, lụng, da; quan sỏt màu sắc cỏc niờm mạc; theo dừi màu sắc, trạng thỏi và mựi phõn, số lần đi ỉa trong ngày; tỡnh trạng ăn uống, vận động của lợn.