4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Ảnh hưởng chế độ khử trùng, chọn nguồn vật liệu ban đầu đưa vào nuôi cấy khởi động loài lan Dendrobium chrysanthum Lindl.
cấy khởi động loài lan Dendrobium chrysanthum Lindl.
Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng chế độ khử trùng chồi đến tỷ lệ mẫu sống trên cây lan Dendrobium chrysanthum Lindl.
Tạo nguồn vật liệu ban đầu là một khâu hết sức quan trọng quyết định sự thành công trong việc nuôi cấy mô. Vật liệu khởi đầu phải được khử trùng để được đảm bảo sản phẩm tạo ra khi nuôi cấy là sạch nấm bệnh, khuẩn… Nguyên tắc của giai đoạn vào mẫu là phải đảm bảo mẫu nuôi cấy sạch và có khả năng phát sinh hình tháị Các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ sạch và tỷ lệ sống của mẫu là nguồn mẫu, hoá chất khử trùng và thời gian khử trùng. Nếu dung dịch khử trùng không có tính sát trùng cao thì mẫu vào sẽ có tỷ lệ bị nhiễm caọ Nếu thời gian khử trùng quá ít thì mẫu sẽ không sạch, còn thời gian quá dài thì mẫu sẽ bị tổn thương và chết.
Phương pháp nhân giống in vitro sử dụng chồi cây làm vật liệu khởi đầu có ưu điểm cây con vẫn giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ, hệ số nhân giống cao hơn so với các phương pháp nhân giống vô tính truyền thống. Tuy nhiên, do chồi được lấy ngoài tự nhiên nên cần phải khử trùng đảm bảo cho mẫu đưa vào nuôi cấy sạch, có khả năng phát sinh hình tháị
Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu chế độ khử trùng đối với chồi cây của loài lan Dendrobium chrysanthum Lindl. Trong thí nghiệm này, các chồi được cấy trên nền môi trường MS + (100ml CW +10g saccarose + 6g agar)/lít MT. Trên cơ sở các kết quả đã tiến hành với lan Hoàng thảo, chúng tôi sử dụng 3 phương pháp khử trùng kép như đã trình bày ở trên kết quả được trình bày trong bảng 4.1.
Ở giai đoạn đầu, công thức 1 (khử trùng kép bằng dung dịch H2O2 2%) cho kết quả tốt hơn so với các công thức còn lại (tỷ lệ mẫu chết là 24,56%), tuy nhiên giai đoạn sau tỷ lệ mẫu nhiễm bệnh lại rất cao (72,30%), và sau 6 tuần thí nghiệm tỷ lệ mẫu sống ở các công thức thí nghiệm cũng chỉ đạt từ 2% – 3,5%.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 48
Bảng 4.1. Ảnh hưởng chế độ khử trùng chồi đến tỷ lệ mẫu sống trên cây lan
Dendrobium chrysanthum Lindl. (sau 6 tuần) Công thức thí nghiệm Tỷ lệ mẫu
chết (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) CT1 24,56 72,30 3,14 CT2 57,42 40,56 2,02 CT3 40,02 56,50 3,48
Thực tế cho thấy, phong lan rừng nói chung và loài lan Dendrobium chrysanthum Lindl. nói riêng sống ở những nơi ẩm thấp, là nơi ẩn náu của rất nhiều loài vi sinh vật gây hại, những loại vi sinh vật này sống cộng sinh trên cây lan. Do đó, khi tách chồi lan để đưa vào nuôi cấy, các vi sinh vật này sẽ dễ dàng xâm nhập vào vết cắt. Việc khử trùng mẫu phải đảm bảo các tiêu chí: Loại bỏ tất cả các vi sinh vật gây hại đồng thời vẫn phải đảm bảo sức sống cho mẫu đưa vào nuôi cấỵ Điều này là hết sức khó khăn bởi nếu tiến hành khử trùng nhiều lần hoặc sử dụng các loại hóa chất đặc hiệu mẫu cấy sẽ bị tổn thương về sinh lý hoặc chết, tỷ lệ mẫu sống ở các công thức thí nghiệm cũng chỉ đạt từ 2% – 3,5% sau 6 tuần nuôi cấỵ Do đó, chúng tôi tiếp tục tiến hành thí nghiệm sử dụng mẫu quả thay cho mẫu chồi non đưa vào nuôi cấỵ
Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng chế độ khử trùng quả đến tỷ lệ mẫu sống và hình thái mẫu phát sinh của loài lan Dendrobium chrysanthum Lindl.
Nhiều công trình nghiên cứu trong nước và thế giới trên đã công bố kết quả nghiên cứu khử trùng mẫu quả của các giống lan (Phạm Thị Kim Hạnh và cs (2009); Nguyễn Quang Thạch và cs (2004)). Kế thừa các kết quả đó chúng tôi tiến hành khử trùng quả lan theo 3 công thức và gieo hạt trên nền môi trường MS + (100ml CW +10g saccarose + 6g agar)/1 lít môi trường. Kết quả được trình bày ở bảng 4.2.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 49
Bảng 4.2. Ảnh hưởng chế độ khử trùng quả đến tỷ lệ mẫu sống và hình thái mẫu phát sinh của loài lan Dendrobium chrysanthum Lindl. (Sau 6 tuần)
CT thí nghiệm Tỷ lệ mẫu sống có
phát sinh chồi (%) Hình thái mẫu
CT1 100 chồi, xanh
CT2 100 chồi, xanh
CT3 100 chồi, xanh
Các thí nghiệm khử trùng quả lan đều cho kết quả tốt, tỷ lệ mẫu sống vô trùng đều đạt 100%. Sau 6 tuần theo dõi, mẫu cấy ở các công thức thí nghiệm đều hình thành nên các chồi màu xanh tương đương nhaụ Tuy nhiên, xét về mặt hiệu quả thì công thức khử trùng 1 (Nhúng quả trong cồn 96º rồi hơ trên ngọn lửa đèn cồn trong 1 phút) có hiệu quả cao nhất vì khử trùng ít công đoạn, dễ thực hiện, ít tốn kém hóa chất và hóa chất sử dụng không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con ngườị
Như vậy, đối với loài lan Hoàng thảo Dendrobium chrysanthum Lindl., nguồn vật liệu đưa vào nuôi cấy tốt nhất là quả lan và chế độ khử trùng tối ưu là nhúng quả trong cồn 96º rồi hơ trên ngọn lửa đèn cồn trong 1 phút.