Năm 1909, Noel Bernard nhà thực vật người Pháp đã phát hiện ra ảnh hưởng của nấm trong việc nảy mầm hạt lan. Ông thấy cây lan con nảy mầm trong rừng đều nhiễm nấm. Ông đã cô lập các nấm ở rễ cây lan con và cấy vào hạt lan, bằng cách này 100% hạt lan nảy mầm.
Thí nghiệm đầu tiên trong nuôi cấy mô, tế bào hoa lan là vào năm 1922, Lewis Knusdson đã chứng minh rằng nấm không cần thiết cho sự nảy mầm của hạt lan nếu hạt được gieo trên môi trường agar có bổ sung muối và đường ở nồng độ thích hợp trong điều kiện vô trùng. Nó đã trở thành môi trường cơ bản cho việc nhân nhanh hạt cho đến ngày naỵ Tuy nhiên, kỹ thuật này tạo ra quá nhiều đa dạng về kiểu gen, trên 50% số cây nhân giống có kiểu hoa khác cây bố mẹ.
Năm 1946, công trình nghiên cứu của Knudson (Mỹ) đã mở ra hướng ứng dụng công nghệ sinh học trong môi trường nuôi cấy lan. Nhờ vậy, người ta đã sản xuất được khối lượng cây lớn trong thời gian ngắn, bảo tồn và duy trì nguồn gen,
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 25 chọn lọc được những giống sạch virus từ các dòng được lai tạo, xây dựng các xí nghiệp sản xuất công nghiệp có sản lượng lớn và giá thành hạ.
Năm 1949, Rotor đã sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào trong việc nhân giống lan vô tính. Ông cấy mắt ngủ của giống lan Hồ điệp vào môi trường gieo hạt, từ các mắt ngủ này hình thành những cây con hoàn chỉnh.
Hơn một thập kỷ sau, Morel (1960) sử dụng chồi đỉnh của Cymbidium cấy vào môi trường KnudsonsC để tạo protocorm và dùng môi trường này để cấy cho hầu hết các loài lan, tuy nhiên cũng có thể thay đổi thành phần chút ít như giảm nitrat canxi xuống 500mg mỗi lít và thêm 500mg sunfat amôn, hay nitrat amôn thêm vào 250mg KCl mỗi lít rất cần thiết cho sự tăng trưởng của các cơ quan. Năm 1964 ông lại tiếp tục thí nghiệm cắt nhỏ thể protocorm và cấy lại vào môi trường, từ một thể protocorm có thể sản xuất hơn 4.000 cây con/năm. Từ kết quả thí nghiệm của Morel rất nhiều giống lan được nhân giống vô tính thành công.
Nhiều tác giả khác dùng các môi trường Vacin và Went, Murashige và Skoog, Heller... thực hiện việc nuôi cấy mô rất tốt cho các loài thuộc nhóm đơn thân.Việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng, như NAA với nồng độ phần triệu (ppm), hoặc 2,4D 1 - 2 ppm rất phổ biến ở nhiều tác giả khác nhaụ Theo tài liệu http://www.lrc.ctụedụvn/pdoc/37/2caymolan.pdf Lê Tuệ Quang (1981) khuyên nên giảm nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng trong những lần cấy chuyển. Các chất chiết trái cây cũng được đề nghị như nước cốt cà chua, nước chuối, nước khoai tâỵ.. nhưng chúng chỉ có hiệu quả trong các lần cấy chuyển hơn là lần cấy đầu tiên, và thể tích cũng không quá 10% môi trường cấỵ Sacharose gây ra sự kích thích mô cấy đối với một số loài lan, và ngược lại cũng gây ra sự ức chế đối với một số loài khác Citokinin có hiệu quả gây sự mọc chồi với đa số loài và với nhiều bộ phận của cây lan. Nhưng những loài hoặc những bộ phận của cây không chịu ảnh hưởng của citokinin, chúng được thay thế bằng axit chanh-cinnamic. Nhiệt độ lý tưởng cho việc nuôi cấy là 220C ± 1 cho đa số các loài đa thân và 260C ± 3 cho đa số các loài đơn thân. Ánh sáng nhân tạo được cung cấp bởi 2 loại đèn huỳnh quang và đèn nóng sáng. Ánh sáng phải được sử dụng liên tục với quang kỳ 16 giờ, 18 giờ hoặc
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 26 24 giờ tùy loài và cường độ cũng thay đổi từ 1.000 đến 2.000ml/m2 khi cây bắt đầu lớn, cường độ ánh sáng có thể tăng lên đến 18.000ml/m2 và quang kỳ giảm xuống. Các đèn phải đặt cách môi trường cấy 0,4 - 0,5m. Độ pH của môi trường thích hợp cho mô phát triển, trong khoảng 4,8 - 5,5, thông thường biên độ pH trong khoảng 5 - 5,2 là tốt nhất.
Các kết quả về cấy mô cho biết rằng, môi trường lỏng được xáo trộn trên máy lắc có hiệu quả hơn môi trường đặc. Tốc độ quay của máy lắc thay đổi tùy theo loài lan và giai đoạn cấỵ Trong giai đoạn đầu, nhờ bộ phận biến trở, ta điều chỉnh máy lắc với tốc độ 1/4 - 1/5 vòng/phút, tốc độ này nhằm mục đích làm cho môi trường dinh dưỡng hòa đều, sau đó tốc độ tăng dần 100 vòng/phút phổ biến cho các loài, 160 vòng/phút cho Cattleya và Dendrobium 200 - 230 vòng/phút cho Cymdium. Thời gian của mô quay trên máy lắc có thể thay đổi tùy loài lan, thường từ 3 - 4 tuần.
Có thể dùng xà phòng rửa bề mặt chồi cấy, sau đó bóc vảy và khừ trùng trong Hipoclorit canxi 7% trong 15 phút. Nhiều người khuyên HgCl2 rất độc cho mô cấy, nên ít được dùng, thực tế có thể dùng HgCl2 với nồng độ 0,1% trong 7 phút.
Nhờ tiến bộ về khoa học, ngày nay trên thế giới người ta có thể cấy nhiều bộ phận khác nhau của cây lan để hình thành các thể giống protocorm (protocorm like bodies) viết tắt là plbs, nhưng thể tích của mô cấy chỉ biến đổi từ 1 - 3mm2. Mô cấy có thể là:
+ Mô phân sinh mô đỉnh và mô phân sinh mô bên
+ Ngoài chồi đỉnh, nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng các bộ phận khác nhau của cây hoa lan để nuôi cấy như mẩu lá, chóp rễ, thân, cành hoa, đỉnh lá, đỉnh rễ, hoa tự.
Mô phân sinh ngọn của nhiều loài lan khi được phân lập vô trùng và nuôi cấy trong ống nghiệm nó sinh ra các thể giống protocorm (plbs) có hình thái tương tự như protocorm tạo ra bởi phôi, và cuối cùng cũng tái sinh ra một cây bình thường. Khi đã có Plbs rồi, người ta cắt thành 3-6 phần. Mỗi phần sẽ được cấy vào môi trong môi trường, một tháng sẽ sản xuất đến 12 plbs mớị Cứ tiếp tục như vậy thì về mặt lý thuyết có thể tạo ra đến 4 triệu cây con từ một chồi duy nhất. Khi người ta ngừng cắt,
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 27 mỗi mầm sẽ tái sinh một cây lan mớị Riêng các loài thuộc giống Vanda, plbs không cần cắt mà qua quá trình lắc, các tế bào bị văng ra và hình thành các plbs mớị Ở một số loài khác, việc cấy chuyển giới hạn trong một số lần nhất định, nếu không các plbs sẽ bị hiện tượng clorotic.
Cây gieo hạt thường được trồng trong điều kiện vô trùng. Do đó việc cấy mô phân sinh, mô đỉnh của chúng sẽ thực hiện dễ dàng hơn cây ở ngoài thiên nhiên.
Năm 1963, Donald ẸVimber đã nghiên cứu trên nhân giống Cymbidium, nhưng nuôi cấy mô trên môi trường lỏng và cũng cho kết quả tốt, tạo ra hàng trăm cây con từ một mô nuôi cấy trong thời gian ngắn (Trần Văn Huân, Văn Tích Lượm, 2002).
Dẫn theo Dương Công Kiên, 2002 thì năm 1967, Robert M. Seulli JR đã nuôi cấy mô phân sinh ngọn và mô phân sinh bên của giống Cattleya trên môi trường Vacin & Went + 25% nước dừa và môi trường Morel + 10% nước dừa + 1ppm NAẠ Kết quả là cây hình thành trong thời gian từ 6 – 8 tuần. Cùng năm 1967, Yoneo Sagawa và T. Shoji cũng nuôi cấy mô phân sinh ngọn và mô phân sinh bên của giống Dendrobium
trên môi trường Knudson C lỏng + 5% nước dừa và Knudson C đặc + 1ppm NAẠ Kết quả mô phân sinh ngọn và mô phân sinh bên ở phần cuối thân hình thành protocorm tốt, còn mô nuôi cấy từ cuống non không tạo protocorm.
Năm 1972, John Kunisaki, Kang-Kwum kim, Yoneo Sagawa đã cấy đỉnh sinh trưởng Vanda lá tròn trên môi trường Vacin & Went đặc hay lỏng có bổ sung 15% nước dừa và 10% đường saccarosẹ Kết quả là các mô nuôi cấy tăng nhanh và phát triển thành các cây non có rễ và có thể đem trồng (Vũ Thị Hoài, 2006).
Năm 2002, Nihar Ranjan Nayak và cộng sự đã nghiên cứu tạo protocorm từ lát cắt chồi lan Cymbidium aloifolium (L.) Sw. and Dendrobium nobile Lindl trên môi trường MS bổ sung một trong ba chất điều tiết sinh trưởng ZR 14.0 µM, N6- benzyladenine (BA) 11.0 µM hoặc kinetin (Kn). Kết quả 85% mẫu cấy của
Cymbidium aloifolium (L.) và 80% mẫu cấy của Dendrobium nobile Lindl hình thành protocorm. (nguồn: http://www.sciencedirect.com/sciencẻ ).
Dendrobium được nuôi cấy tái sinh thành công từ tế bào soma (Meesawat & Kanchanapoom, 2002). Sagawa (1900ab) nuôi cấy tạo tế bào soma thành công. Inchihashi et al (1993) tái sinh thành công tế bào somạ Phôi giả (PLB) của
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 28
Cymbidium cũng đã được nuôi cấy thành công bởi Begum et al (1994b), Huan & Tanaka (2004ab).
Bảng 2.1. Một số kết quả đạt được trong nhân giống một số loài Dendrobium
bằng phương pháp nuôi cấy mô
Tên loài Mẫu cấy Kết quả Tác giả
D. bigibbum Lind Các đoạn thân Tái sinh các chồi bên
Kukylezanka and
Wojciechowska
D. spp Các ngọn chồi Tạo protocorm và tăng sinh nhanh protocorm
Morel (1965)
D.spp. Các mắt thân của cây trưởng thành
Cho sự kéo dài chồi bên
Ball and Arditti
(1976) D. superbiens var.superba Dỉnh sinh trưởng chồi ngọn Tạo protocorm và tăng sinh nhanh protorm
Morel (1974)
D. lacniosum Đỉnh sinh trưởng của chồi ngọn và chồi bên
Tạo sự khởi đầu và nhân nhanh tiền củ (protocorm) Lim-Ho (1982) D. spp Ngọn chồi và chồi bên Tạo protocorm và tái sinh cây con
Sagawa and
Kunisaki (1982)
D.Miss Hawaii Các mắt của cọng hoa
Tái sinh chồi từ mắt
Nuraini and
Mohd.Shaib (1992)
Nguồn: George, 1993
Nhân giống qua nuôi cấy chồi đỉnh: Nhân giống Dendrobium đầu tiên được thực hiện tại Đại học Hawaii (Sagawa và Shoji, 1967; Kim và cs, 1970) qua nuôi cấy chồi đỉnh. Gandawijaja (1980) nuôi cấy chồi đỉnh Dendrobium phalaenopsis. Fernando (1979) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Dendrobium Caesar Lip. Singh (1976) nuôi cấy chồi đỉnh Dendrobium. Ng Eng Cheọ Soediono (1983b) nuôi cấy chồi đỉnh Dendrobium jaquelyn Thomas ‘White’.
Nhân giống qua nuôi cấy chồi bất định: Khaw và cs (1978a, 1978b) nuôi cấy chồi bất định Dendrobium. Khaw và Ong (1974) nuôi cấy chồi bất định Aranda và
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 29 nuôi cấy chồi bất định Dendrobium antennatum và Dendrobium phalaenopsis.
Nhân giống Dendrobium joannie ostenhault qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng: Sharon và Vasundhara (1990) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tách rời trên môi trường lỏng VW có bổ sung 15% nước dừa, đặt trong tối 48h, sau đó đưa ra sáng, tạo PLB. PLB được cấy chuyển, nhân sinh khối và tái sinh thành chồi trên môi trường bán rắn VW có bổ sung 15% nước dừạ
Nhân giống Dendrobium qua nuôi cấy đốt thân: Arditti và cs (1973), Mosich và cs (1973, 1974a,b) nuôi cấy đốt thân trên môi trường Knop, chồi xuất hiện sau 45 ngày nuôi cấy, chồi được tách rời và nuôi cấy ra rễ.
Nhân giống Dendrobium crumenatum qua nuôi cấy mô lá: Phương pháp này được được trường ĐH Quốc Gia Singapore phát triển (Manorama và cs, 1986). Gieo hạt Dendrobium crumenatum in itro, chồi tái sinh từ hạt tách lấy lá non. Lá non được cắt thành mảnh mỏng và nuôi cấy trong môi trường lỏng VW (lắc 80rpm) có bổ sung 2,4D (5mg/l), NAA (5mg/l), BA (2mg/l). Mô sẹo hình thành sau 40 ngày nuôi cấy và tạo PLB sau 3 tháng nuôi cấỵ
Nhân giống Dendrobium moschatum qua nuôi cấy lát mỏng thân: Kanjilal và cs (1999) nuôi cấy lát mỏng thân (dày 1-1,5mm) của chồi từ hạt in vitro trên môi trường lỏng KnudsonC (lắc 80-120rpm) có bổ sung 15% nước dừa, 2mg/l NAA và 3mg/l BA tạo PLB. Nuôi cấy tăng sinh và tái sinh PLB trên cùng môi trường bán rắn.
Nhân giống Dendrobium Sonia: Rrasad và cs (2001) đã nuôi cấy chồi đỉnh trên môi trường MS có bổ sung 1mg/l NAA và 1mg/l BA hình thành cụm chồi sau 25 ngày nuôi cấy, với 11 chồi/mẫụ
Nghiên cứu sự tạo mô sẹo trên Dendrobium cho thấy:mô sẹo sinh trưởng chậm, dễ bị hoại tử trong quá trình nuôi cấy (Chang và Chang 1998; Lin và cs, 2000; Roy và Banerjee, 2001; Lu 2000). Hơn nữa môi trường nuôi cấy tạo mô sẹo có bổ sung auxin, cytokinin, nước dừa cho kết quả khích lệ (Yam và cs, 1991, Arditti và Ernst 1993) và duy trì được mô sẹo (Ishii và cs, 1998; Lin và cs, 200; Chen và Chang 2000; Huan và cs, 2004). Tuy nhiên, nuôi cấy kéo dài trong môi trường có chất kích thích sinh trưởng dẫn đến biến tính tế bào soma (Vazquez, 2001) và cần điều khiển auxin và xytokinin
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 30 thích hợp trong tái sinh mô sẹo hình thành chồi và PLB (Roy và cs, 2007).
Chung và cs (2007) thành công trong nuôi cấy phát sinh phôi vô tính trực tiếp từ lá giống hoa lan Dendrobium chiengmai pink đã nghiên cứu ảnh hưởng của 4 loại auxin (2,4D; NAA; IBA; IAA) và 5 loại cytokinin (Ki, BA, 2ip, TDZ, zeatin) trên môi trường ½ MS đến sự tạo mô sẹo đã trực tiếp ghi nhận auxin không ảnh hưởng đến sự hình thành phôi vô tính trong tối và ngoài sáng sau 60 ngày nuôi cấy; phôi phát sinh tốt với 1mg/l TDZ với 5-25% mẫu nuôi cấy tạo phôi và đạt 33,6 phôi/mẫu; phôi thứ cấp phát sinh trên vết cắt bản lá và có tần suất tạo phôi cao để trong tối; NAA (0-0,1-1mg/l) kết hợp TDZ (0-0,3-3mg/l) nâng cao hiệu suất hình thành phôi; chồi tái sinh từ phôi dễ dàng trên môi trường ½ MS không chất kích thích sinh trưởng và có tỷ lệ sống cao khi thuần hóạ
Roy và cs (2007) đã thành công trong nghiên cứu nhân giống Dendrobium qua con đường nuôi cấy tạo mô sẹo và tái sinh PLB Dendrobium chrysotoxum Lindl. Trên môi trường MS, tần suất tạo mô sẹo cao với µM TDZ hay BA; mô sẹo tạo PLB và chưa thấy xuất hiện biến tính tế bào soma sau 18 tháng nuôi cấy trên môi trường không bổ sung chất kích thích sinh trưởng; tuy nhiên sự hình thành PLB phụ thuộc nhiều vào tỷ lệ cytikinin và auxin cũng như kỹ thuật nuôi cấy, hệ số tăng sinh mô sẹo khi bổ sung 0,5mg/l NAA là 69 lần sau 3 tháng nuôi cấy, tái sinh sẹo đạt hiệu quả cao nhất (133 PLB/100mg mô sẹo) với môi trường bổ sung 1µM NAA, PLB Dendrobium được sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy chuyển gen trong công tác tạo giống mới (Kuehnle và Sugii (1992); Chia và cs (1994); Tee và cs (2003); Janna và cs (2006)).
Nhân giống Dendrobium nobile qua nuôi cấy lớp mỏng tế bào: Nayak và cs (2002) đã nuôi cấy lớp mỏng tế bào trên môi trường bán rắn MS có bổ sung 2,5mg/l BA hình thành PLB và PLB được nuôi cấy tái sinh trên môi trường MS không có chất kích thích sinh trưởng.
Ricardo T. de Faria (2004) đã đề xuất nuôi cấy lan Dendrobium nobile bổ sung 60g sacarose/lít môi trường vào môi trường MS cho hiệu quả cao nhất về mức độ tăng trưởng chiều cao và trọng lượng tươi của cây trong ống nghiệm.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 31 Ye Qingsheng (2003) đã đưa ra môi trường nuôi cấy bao gồm 1/2 MS, NAA, nước trái cây chuối 50%, mía đường, carbon và điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ từ 25- 280C, cường độ chiếu sáng 2000-3000 lux, trong 25-30 ngày và thời gian chiếu sáng 10-12 giờ/ngày để tăng sinh chồi Dendrobium nobile Lindl.
Các chồi Dendobium nobile Lindl. được khử trùng và cấy vào môi trường MS + (BA 2,0mg + NAA 0,5mg + 2,0% saccarose)/lít. Các chồi cây tái sinh sau đó đã được nuôi trong MS + (2,0mg BA + 1,0mg NAA + 2,0% saccarose)/lít và tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường MS + (2,0mg KT + 0,5mg IBA + 2,0% saccarose)/lít (Sun Ting1, Yang Yu-zhen, Tao Jie1, Hu Shu-xiao, 2005).