in vitrọ
Trong nuôi cấy invitro sự tăng trưởng của cây phần lớn được xác định bởi các thành phần môi trường cấỵ Thành phần chính của hầu hết môi trường nuôi là các thành phần khoáng, đường được xem như là nguồn cung cấp carbon và nước. những thành phần khác được bổ xung bao gồm các chất hữu cơ, các chất điều tiết sinh trưởng, các chất làm đặc môi trường. Mặc dù các thành phần khác nhau trong môi trường thay đổi theo các giai đoạn cấy và loài cây, môi trường MS (Murashige and Skoog) hầu hết được sử dụng phổ biến nhất.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 34
* Khoáng đa vi lượng
Các chất khoáng cung cấp cho cây trong nuôi cấy mô đều ở dạng các muối vô cơ, cây lan có thể thích nghi phổ rộng các hỗn hợp muối vô cơ.
Đạm là thành phần của acid nucleic đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất, là thành phần chủ yếu của chất nguyên sinh tế bào (Moxolov, 1987), do đó có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của câỵ Đạm được sử dụng trong nuôi cấy thường là dạng ammonium (NH4+) và nitrate (NO3-).
Lân tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic và tham gia vào cấu trúc màng. Lân thường được sử dụng ở hai dạng ion là HPO42- và H2PO4-.
Nồng độ khoáng đa lượng và vi lượng trong môi trường ra rễ thường giảm xuống còn một nửa so với bình thường (tùy thuộc loài cây). Nguyên nhân có lẽ do nhu cầu về đạm trong giai đoạn này giảm xuống (Nguyễn Đức Lương và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
* Vitamin
Thực vật nói chung cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamine HCl (B1); Pyridoxine HCl (B6); Acid Nicotinic; Myo-inositol (Nguyễn Đức Lương và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
* Sắt
Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelate kết hợp với Na2-Ethylen Diamin Tetra Acetat (EDTA). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng dần ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật (Trần Văn Minh – Viện Sinh học nhiệt đới).
* Carbon
Nguồn carbon (Sucrose; Glucose hoặc Fructose) là một thành phần quan trọng trong môi trường nuôi cấy mô. Các lĩnh vực vi nhân giống cho rằng sự hiện diện của đường trong môi trường cấy là quan trọng vừa cho sự phát triển rễ và nhân chồi, vừa làm tăng chiều cao cây con. Nồng độ sucrose (20 – 30g/l) thường được
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 35 thêm vào môi trường để đẩy mạnh tăng nhanh protocorm và sự phát triển của cây con. Theo Debergh (1991), sự vắng mặt của đường làm giảm các vấn đề về nhiễm môi trường cấy và cho phép các cây tăng trưởng tự dưỡng trong điều kiện in vitro khi nồng độ CO2 và mật độ ánh sáng tăng lên.
* Các chất hữu cơ
Nước dừa (coconut water – CW) được dùng thông dụng trong nuôi cấy mô. Nước dừa cung cấp bổ sung cho môi trường các loại đường, amino acid, chất sinh trưởng và các chất trao đổi khác. Nước dừa chỉ kích thích những tế bào hay mầm còn non chưa trưởng thành và sự phát triển phôi, nước dừa thường dùng ở nồng độ 15%. Từ việc sử dụng nước dừa, nhiều mô thực vật được nghiền tách dịch chiết và bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển cây như chà là, chuối, mầm lúa mì,… nhưng thông dụng thường các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùng nguồn gốc (Trần Văn Minh, 1997). Nước cốt cà chua, dịch chiết khoai tây nghiền, dịch chiết quả chuối, dịch chiết cà rốt, dịch chiết quả táo, casein thuỷ phân (casein hydrolysate) cũng được sử dụng để làm tăng sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy (Lê Văn Hoàng, 2007).
* Than hoạt tính
Than hoạt tính có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định. Nó có tác dụng hấp thu các chất hữu cơ ngoại trừ đường. Sự kết hợp của 0,3% than hoạt tính trong môi trường đã được nghiên cứu là có lợi cho sự tăng trưởng cả chồị ngoài ra việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường còn góp phần làm tăng nhanh protocorm và sự phát triển cây con (Nguyễn Đức Lương và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
* Các chất điều tiết sinh trưởng
Năm 1955 Miller và Skoog phát hiện và chiết xuất từ tinh dịch cá thu một hợp chất có khả năng kích thích sự phân chia tế bào rất mạnh mẽ trong nuôi cấy mô gọi là kinetin (6-furfuryl aminopurin – C10H9N5O).
Letham và Miller (1963) lần đầu tiên đã tách được cytokinin tự nhiên ở dạng kết tinh từ hạt ngô gọi là zeatin và có hoạt tính tương tự kinetin. Người ta cũng đã phát hiện ra kinetin là loại cytokinin có nhiều ở trong nước dừạ
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 36 Cytokinin được vận chuyển trong cây không phân cực như auxin, có thể vận chuyển theo hướng ngọn và hướng gốc. Cytokinin có thể ở dạng tự do và dạng liên kết tương tự như các phytohormone khác. Ở trong cây chúng bị phân giải dưới tác dụng của enzyme tạo nên sản phẩm cuối cùng là urê. Các cytokinin tổng hợp được sử dụng trong kỹ thuật nuôi cấy mô là kinetin và benzyladenin (Edwin F. Geogre, 1993). Cytokinin có vai trò kích thích phân chia tế bào mạnh mẽ. Vì vậy người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào, nguyên nhân là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp axit nucleic và protein dẫn đến sự phân chia tế bàọ
Auxin là một hormone kích thích sinh trưởng có ở mô phân sinh chồi, lá, mầm và rễ. Auxin có tác động kích thích nhiều hoạt động sinh trưởng làm trương giãn tế bào, tác động đến tính hướng đất làm cho chồi ngọn và rễ chính sinh trưởng mạnh, ức chế sinh trưởng chồi bên, kích thích sự ra quả và tạo quả không hạt, ức chế sự rụng. Trong nuôi cấy mô thực vật, muốn kích thích mô ra rễ người ta dùng auxin.
Hiện nay, hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cây mô là auxin và xytokinin. Sự cân bằng hàm lượng auxin và xytokinin trong môi trường nuôi cấy quyết định sự phát sinh chồi hay rễ. Các auxin thường được sử dụng là IAA, 2,4D, α-NAA . Còn xytokinin có thể là kinetin, BAP hoặc nước dừạ
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 37