2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.3. Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bằng sinh trắc nghiệm
lệ ánh sáng đơn sắc đến sự hình thành PLB từ phôi lan Hồ điệp in vitro.
Mẫu cấy phôi lan Hồ điệp in vitro được cấy vào môi trường Vacin – Went (VW) được bổ sung 2 mg/l BA kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 8 g/l agar, 20% nước dừa (v/v), 1g/l than hoạt tính, pH = 5,7 - 5,8. Mẫu cấy sau khi cấy vào môi trường được đặt vào buồng sáng với tỉ lệ ánh sáng đơn sắc khác nhau (90% đỏ + 10% xanh, 80% đỏ + 20% xanh, 70% đỏ + 30% xanh, 100% đỏ, 100% xanh), đèn huỳnh quang và tối hoàn toàn.
Chỉ tiêu theo dõi: số lượng PLB, số chồi/cụm, trọng lượng tươi (TLT) và trọng lượng khô (TLK).
2.3. Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bằng sinh trắc nghiệm nghiệm
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có thể được ly trích nhờ sử dụng dung môi hữu cơ metanol, etanol, acetone, chloroform… và thay đổi pH thích hợp. Sau đó, các chất này được cô lập thông qua phương pháp sắc ký bản mỏng silicagel. Vị trí của các chất trên bản mỏng sắc ký được phát hiện dưới đèn UV ở bước sóng 245nm. Giá trị Rf là tỉ số giữa đoạn đường di chuyển của chất phân ly và đoạn đường di chuyển của dung môi.
Hoạt tính của các chất auxin (AIA), cytokinin (zeatin), giberelin (GA3) và acid abscisic (ABA) xác định thông qua sinh trắc nghiệm.
Nghiền 3 – 6 g mẫu vật trong 40ml methanol 80% và ngâm trong 48 giờ. Lọc và rữa bã 2 lần với methanol 80%. Cô cạn dịch lọc, sau đó hòa với 10 ml nước cất. Sự ly trích và phân đoạn được tiếp tục theo sơ đồ tóm tắt trong hình 2.1.
Sắc ký: xác định vị trí auxin, cytokinin, giberelin và ABA được thực hiện bằng phương pháp sắc ký trên bảng mỏng silicagel
Bản mỏng silicagel F254, dùng bút chì chia thành các hàng, kích cỡ khoảng 2cm. Sử dụng micropipet chấm dịch eter đã quạt cạn ở trên thành 1 điểm cách mép
của bản mỏng 2cm. Chú ý, sau mỗi lần chấm, dùng máy sấy làm khô vị trí này và sau đó tiếp tục chấm cho đến khi hết dịch eter. Chấm 1 điểm tương tự với hỗn hợp chất chuẩn (khoảng 50ul) gồm Zeatin (Zea), AIA, ABA và GA3 tinh khiết có nồng độ 200mg/l cho mỗi chất.
Đặt bản mỏng sắc ký vào thùng sắc ký và sử dụng dung môi di chuyển được chloroform : metanol : acid acetic = 80 : 15 : 5 (theo thể tích). Theo mao dẫn, dung môi sẽ di chuyển dọc trên bản mỏng sắc ký và tùy thuộc vào đặc tính hòa tan của các chất mà chúng sẽ được phân ly tại các vị trí khác nhau trên bản sắc ký. Khi mức dung môi di chuyển còn cách mép trên của bản sắc ký khoảng 1cm, sự sắc ký được kết thúc. Lấy bản sắc ký ra khỏi thùng dung môi, dùng bút chì đánh dấu mực dung môi và làm khô bản sắc ký này.
Hình 2.1. Sơ đồ ly trích chất kích thích và chất cản tăng trưởng (AIA, ABA.GA3 )
Phát hiện và cô lập:
Sử dụng đèn UV chiếu trên bản mỏng silicagel để phát hiện và xác định vị trí của AIA, Zeatin, GA3 và ABA trên bản sắc ký. Các vị trí này tùy thuộc nhiều vào hệ dung môi di chuyển và nhiệt độ môi trường triển khai sắc ký, thí dụ ở nhiệt độ 30-320C và hệ dung môi di chuyển như trên, dưới tia UV, vị trí của các chất trên bản sắc ký sẽ là: GA3 (Rf=0,45-0,48), Zea (Rf =0,55-0,6), AIA (Rf = 0,84-0,88) và ABA (Rf = 0,88-0,92). Tương ứng các vị trí này của các chất chuẩn, hỗn hợp các chất nội sinh sẽ được phát hiện và cô lập riêng bằng cách dùng dao lam cạo các hạt silic từng vùng trên bản sắc ký và cho vào đĩa petri để chuẩn bị sinh trắc nghiệm.
Sinh trắc nghiệm:
AIA và ABA:
Auxin và acid abscisic là hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật có tác dụng trái ngược nhau. Auxin thuộc nhóm kích thích, trong khi acid abscisic thuộc nhóm chất cản. Cả hai đều có thể li trích và sinh trắc nghiệm cùng một phương pháp, cùng một vật liệu. Auxin kích thích tăng dài mô còn non, trong khi acid abscisic lại cản sự kéo dài này.
Chuẩn bị các petri:
Petri 1: 10ml dịch ngâm AIA (Rf = 0,84-0,88) sau 24 giờ. Petri 2: 10ml dịch ngâm ABA (Rf =088-0,92) sau 24 giờ.
Petri 3: 10ml dịch ngâm AIA 1mg/l.
Petri 4: 10ml dịch ngâm ABA 1mg/l.
Petri 5: 10ml nước cất.
Bóc vỏ khoảng 200 hạt lúa và ngâm trong dung dịch KMnO4 5‰ (15 phút). Hột được rửa sạch và ngâm bão hòa nước khoảng 2 giờ. Sau đó, gieo hột trên giấy thấm ẩm trong thau nhựa, dùng giấy đậy kín và đặt trong tối. Khoảng 2 ngày sau, diệp tiêu mọc đứng thẳng, cao khoảng 15mm.
Cắt diệp tiêu (dưới ánh sáng đỏ -trong phòng tối): cắt bỏ một đoạn khoảng 5mm ngọn diệp tiêu, cắt bỏ gốc diệp tiêu về phía hột và rút lá mầm ra khỏi diệp tiêu, cắt bỏ gốc diệp tiêu về phía hột và rút lá mầm ra khỏi diệp tiêu. Dùng dao cắt chuyên biệt cắt trên phiến parafin. Các khúc cắt được cho vào một hộp petri chứa nước cất. Sau 24 giờ, chiều dài tổng cộng của các khúc cắt diệp tiêu ở mỗi hộp so với chuẩn sẽ thể hiện tác động của các chất kích thích hay cản tăng trưởng. Sai biệt của các chỉ số tăng trưởng diệp tiêu từ mẫu trích, mẫu chuẩn tinh khiết và đối chứng sẽ xác định được hoạt tính tương đương AIA hay ABA..
Nhóm dùng dao lam ghép lại để cắt diệp tiêu thành các khúc bằng nhau, mỗi khúc cắt dài 2mm.
GA3:
Giberelin là chất điều hòa sinh trưởng thực vật thuộc nhóm kích thích. Acid Giberelic (Gb) có hoạt tính mạnh, thường được sử dụng trong sinh trắc nghiệm Gb. Gb hiện diện nhiều trong các mô, cơ quan đang tăng trưởng và phát triển. Gb có đặc tính:
Kích thích tăng dài phiến lá đơn tử diệp. Kích thích sự tăng dài trụ hạ diệp. Kích thích hoạt động sinh mô lóng.
Kích thích tổng hợp enzym -amylaza, từ đó kích thích sự nảy mầm của hột. Kích thích ra hoa của cây ngày dài trong điều kiện ngày ngắn.
Chuẩn bị các erlen (dung tích 50ml):
-Erlen 1: 5ml dịch ngâm GA3 (Rf=0,45-0,48) sau 24 giờ -Erlen 2: 5ml dung dịch GA3 tinh khiết 10 mg/l
-Erlen 3: 5ml nước cất
Dùng 50 hạt xà lách, rửa sạch và ngâm trong nước 1 giờ. Hột được gieo vào hột petri với giấy thấm ẩm, trong tối. Sau 24 giờ, khi rễ mầm vừa chui ra khỏi vỏ, đặt 10 hột xà lách vừa nảy mầm vào erlen đã chuẩn bị ở trên. Bao phủ becher bằng giấy parafim và đặt vào phòng tăng trưởng có ánh sáng liên tục với cường độ 3000 lux, nhiệt độ 28 ± 20C. Sau 72 giờ, đo chiều cao của trụ hạ diệp cây mầm xà lách bằng thước mm. Sự sai biệt về chiều cao trụ hạ diệp trong mỗi dung dịch so với chuẩn và các chất tinh khiết sẽ cho biết hoạt tính tương đương của GA3 nội sinh.
Zeatin:
Cytokinin là một chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm kích thích. Ngoài tác dụng trên sự phân bào, cytokinin còn kích thích tăng trưởng qua gia tăng trọng lượng tươi, hay giữ cho lượng diệp lục tố chậm bị phân hủy trong tối.
Dùng giấy thấm quấn quanh 2 tấm lam. Đặt mỗi lam đã được quấn giấy thấm vào:
Petri 1: 10ml dịch ngâm Zea (Rf = 0,55 - 0,6) sau 24 giờ Petri 2: 10ml dung dịch Zea tinh khiết 1mg/l
Dùng 20 hột dưa chuột, rửa sạch và ngâm trong nước 1 giờ và được gieo vào hộp petri lót giấy thấm ẩm, trong tối. Khi rễ mầm vừa chui ra khỏi vỏ 5mm (khoảng 24 giờ), cẩn thận lột bỏ vỏ cứng và phần bao hai tử diệp. Cắt rời 2 tử diệp với mầm, cho phần tử diệp vào nước cất.
Cân 5 tử mãnh tử diệp bằng cân phân tích. Đặt 5 mãnh tử diệp lên lam, mặt trong của tử diệp úp xuống, vào mỗi hộp petri đã chuẩn bị như trên. Các hộp petri được đặt ở phòng tăng trưởng có ánh sáng liên tục với cường độ 3000 lux, nhiệt độ 28 ± 20C. Sau 48 giờ, thu tử diệp, thấm khô và cân lại để xác định sự sai biệt trọng lượng trước và sau khi thí nghiệm. Sự sai biệt trọng lượng này từ các mẫu sẽ cho biết hoạt tính tương đương của Zea nội sinh.