IV. KÉT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN
2. Thực nghiệm
3.1. Khảo sát các yếu tổ ảnh hưởng tói quá trình phân tích
Các vitamin nhóm B hấp thụ ánh sáng mạnh trong vùng tử ngoại (UV). Do đó chúng tôi chọn detector PDA để quan trắc các vitamin tại bước sóng trong vùng từ 200 nm đến 350 nm. Quét phổ hấp thụ của dung dịch chứa các vitamin riêng rẽ Bl, B2, B3, B6 và BI2. Các bước sóng cực đại hấp thụ để phát hiện các vitamin tương ứng như sau: BI (246 nm), B2 (268 nm), B3 (261 nm), B6 (290 nm), B12 (361 nm).
*Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động-. Chúng tôi khảo sát thành phần pha động theo 2 hướng: sừ dụng phương pháp rừa giải gradient để tối ưu điều kiện rửa giải các vitamin nhóm B và khảo sát chế độ chạy sắc ký pha động thành phần không đổi (isocratic) theo tỷ lệ tăng dần ACN trong thành phần pha động.
• Khi khảo sát thành phần pha động theo phương pháp isocratic, với kênh A là dung dịch đệm photphat NaH2P 04 (0,01M, pH = 3,0) + 5mM Natri heptan sulfonat và kênh B là ACN, chúng tôi nhận thấy do các vitamin B là các chất tan tốt trong nước nên khi tăng tỳ lệ ACN thì thời gian lưu giữ của chất phân tích trên cột tăng dẫn đến các vitamin được tách ra muộn gây doãng chân pic và làm giảm độ nhạy của phương pháp phân tích. Ví dụ với tỷ lệ thể tích ACN/đệm photphat là 10/90 thì các chất được tách ra tương đối tốt nhưng thường bị doãng chân pic. Ngược lại, khi giảm tỉ lệ ACN thì tuy thời gian lưu giữ các chất phân tích trên cột sắc ký giảm, các vitamin được tách ra sớm, chiều cao pic tăng nhưng không tách được hoàn toàn các vitamin; cụ thể với ti lệ thể tích ACN/đệm photphat là 5/95 thì chi tách được 2 trong số 5 vitamin (3 vitamin B2, B6. B12 không tách khoi nhau). Như vậy chế độ isocratic không phù hợp để tách các vitamin nhóm B ra khỏi nhau.
• Kết quả khảo sát quá trình tách hỗn hợp 5 vitamin nhóm B theo phương pháp rửa giải gradient với hai kênh dung môi pha động A và B như ưên cho thấy các vitamin B được tách ra khỏi nhau lần lượt trong khoảng thời gian lưu từ 13 đên 32 phút, các pic có độ đôi xứng tôt và không xảy ra hiện tượng doãng chân pic. Chế độ rửa giải gradient với chương trình như ờ bảng 1 được xem là tối ưu nhất để tách các vitamin nhóm B ra khỏi nhau và giữ không đổi trong các lần khảo sát tiếp theo.
Bảng 1: Chương trình rửa giải gradient của pha động
(Kênh B : Đệm photphat NaH2P 04 (0,01M, pH = 3,0) + 5mM Natri heptan sulfonat; kênh A : ACN)
Thời gian (phút) 0,01 1 3 15 19 23 25 27 35
% thê tích A 2 5 5 15 15 2 0 2 0 2 2
% thế tích B 98 95 95 85 85 80 80 98 98
bằng cách thay đổi các giá trị pH lần lượt 2,5; 2,7; 3 và 3,5. Thực nghiệm cho thấy, độ phân giải R giữa vitamin B2 và B6 tăng dần tương ứng là 1,84; 1,98; 2,24 và 2,70. Như vậy, pH trong khoảng khảo sát không ảnh hưởng quá nhiều đến khả năng tách cũng như độ phân giải R. Tuy nhiên, giá trị R chỉ cần vừa đủ để tách hoàn toàn hai chất ra khỏi nhau, do đó chúng tôi chọn dung môi pha động có pH = 3 để nghiên cứu các yếu tố khác trong quá trình phân tích. Hình 1 là sắc đồ chuẩn hỗn hợp 5 vitamin B|, B2, B3, B6, B|2 thu được ở điều kiện tối ưu đã chọn.
Từ các kết quả khảo sát về chọn detector, bước sóng, loại cột tách, thành phần pha động, pH cùa dung dịch đệm..., điều kiện tối ưu cho quá trình phân tích các vitamin B với hệ thống RJP-HPLC được chọn như sau:
- Cột tách là cột đào pha C18, chiều dài cột là 250mm, đường kính cột 6,1 mm. kích thước hạt 5um; nhiệt độ cột tách 40°c.
- Thành phần pha động: theo chế độ rửa giải gradient gồm hai kênh là ACN và dung dịch đệm photphat 0,0IM (pH = 3). Tốc độ pha động
Hình ỉ: sắc đồ chuẩn hỗn hợp năm vitamin B theo J L hút
chương trình chạy gradient. B3 (13, min.), B ỉ2 J-Jetect0r PDA bước sóng X chọn lọc đối
(22,3 min.), B6 (24,5 min.), B2 (25,5 min.), BI v ớ i ^ v ita m in : B I ( 2 4 6 n m ) , B 2 ( 2 6 8
(32,9 min.) ^ 3 3 (261 run), B6 (290 nm), B12
(361 nm).
