IV. KÉT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN
4.1.3. Nghiên cứu chọn hệ dung môi pha động
Việc lựa chọn pha động HPLC tày thuộc vào nhiều yếu tố: bản chất của chất tan, bản chất của quá trình sắc ký, bản chất của pha tĩnh. Đặc điểm của sắc ký hấp phụ pha ngược là pha tĩnh không hay rất ít phân cực và ngược lại pha động là hệ dung môi phân cực. Do đó, chất tan ít phân cực sẽ bị lưu giữ trong
cột lâu hơn các chât tan phân cực khác. Các dung môi pha động thường dùng trong sắc ký lỏng pha ngược là axetonitril, metanol, dung dịch đệm, nước.
Qua tham khảo các công trình nghiên cứu và kinh nghiệm thực tế, chúng tôi chọn hệ pha động axetonitril/dung dịch đệm photphat để nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện phân tích.
4.1.3.1. Khảo sát tỳ lê thành phần pha đônọ
Chúng tôi khảo sát thành phần pha động theo 2 hướng: sử dụng phương pháp rửa giải gradient để tối ưu điều kiện rửa giải các vitamin nhóm B và khảo sát chế độ chạy sắc ký pha động thành phần không đổi (isocratic) theo tỷ lệ tăng dần ACN trong thành phần pha động. Các điều kiện chạy sắc ký của hệ HPLC được cố định như sau:
- Cột Supelco C18 (250mm X 5mm X 6,1 jam) - Tốc độ dòng: lml/phút
- Pha động: kênh A: Đệm photphat K H 2 P O 4 (0,0IM, pH = 3,0) + 5mM Natri heptan sulfonat; kênh B : ACN
- Nhiệt độ cột: 40°c
- Detector: PDA đặt ở các bước sóng định lượng như đã khảo sát ở trên - Mầu phân tích: dung dịch chuẩn các vitamin nhóm B
• Khi khảo sát thành phần pha động theo phương pháp isocratic, chúng tôi nhận thấy do các vitamin B là các chất tan tốt trong nước nên khi tăng tỷ lệ ACN thì thời gian lưu giữ của chất phân tích trên cột tăng dẫn đến các vitamin được tách ra muộn gây doãng chân pic và làm giảm độ nhạy của phương pháp phân tích. Ví dụ với tỷ lệ thể tích ACN/đệm photphat là 10/90 thì các chất được tách ra tương đối tốt nhưng thường bị doãng chân pic. Ngược lại, khi giảm ti lệ ACN thì tuy thời gian lưu giữ các chất phân tích trên cột sắc ký giảm, các vitamin được tách ra sớm, chiều cao pic tăng nhưng không tách được hoàn toàn các vitamin; cụ thể với tỉ lệ thể tích ACN/đệm photphat là 5/95 thì chì tách được 2 trong số 5 vitamin (3 vitamin B2, B6, B12 không tách khỏi nhau). Như vậy chế độ isocratic không phù hợp để tách các vitamin nhóm B ra khỏi nhau.
• Khảo sát phương pháp chạy chế độ gradient để tối ưu điều kiện rửa giải các vitamin nhóm B
Kết quả thực nghiệm ở trên cũng như các công trình nghiên cứu cho thấy khi quá trình tách sắc ký chưa xác định được, chúng ta thường sử dụng phương pháp tách đơn giản rửa giải gradient để biết rõ các đặc tính kỵ nước của hợp chất chưa biết [28]. Vì vậy, trong những năm gần đây đa số các chế độ chạy sắc ký đã được dựa trên chế độ chạy thành phần gradient trong pha động.
Trong chương trình chạy gradient, nồng độ của dung môi được tăng dần theo thời gian chạy sắc ký. Trong sắc ký lỏng pha ngược thành phần của pha động tại thời điểm bắt đầu chạy thì tỉ lệ nước chiếm ưu thế và thành phần phần trăm của dung môi hữu cơ bổ sung (như metanol hay axetonitril) được tăng dần theo thời gian, theo cách này nồng độ dung môi tách tăng dần. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hệ dung môi pha động với tỷ lệ ACN/đệm photphat thay đổi theo thời gian, các điều kiện khác giữ nguyên không đổi.
Bảng 4.2: Thành phần pha động
GRADIENT 1 GRADIENT 2 GRADIENT 3 GRADIENT 4
Thời % Thời % Thời % Thòi %
gian ACN gian ACN gian ACN gian ACN
0.01 2 0.01 5 0.01 0 0.01 2 1 5 1 5 3 5 3 5 3 5 15 20 15 20 15 15 15 15 19 20 19 20 19 15 19 15 20 30 23 20 23 20 25 30 25 5 25 20 25 20 27 2 27 5 27 0 27 20 30 2 30 5 30 0 30 2 1 35 ■ 2 23
Khi thay đổi tỷ lệ thể tích các thành phần pha động khác nhau, kết quả phân tích thời gian lưu 5 vitamin thu được ở bảng sau:
Bảng 4.3: Thời gian lưu của các vitamin ờ các thành phần pha động khác nhau
Vitamin
Thành phần pha động
Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3 Gradient 4
Vitamin BI 26.5 25.7 ND 32.9
Thời
Vitamin B2 21.3 21.5 25.5 25.5 gian lưu
(phút)
Vitamin B3 13.4 13.4 13.7 13.7
Vitamin B6 21.4 2 1 . 6 24.3 24.5
Vitamin B12 19.1 19.0 2 2 . 2 2 2 . 3
Ghi chú: ND: Không có tín hiệu pic sắc kỷ
Kết quả khảo sát quá trình tách hỗn họp 5 vitamin nhóm B theo phương pháp rửa giải gradient với hai kênh dung môi pha động A và B như trên cho thấy: Với chế độ rửa giải gradient 1 và 2, các pic của vitamin B2, B6 hầu như không tách. Với chế độ gradient 3, độ phân giải R giữa B2, B6 là 2,2 ; hai pic tách nhau tương đối tốt. Tuy nhiên, không xác định thấy pic của B l, do đó, cần kéo dài thời gian phân tích từ 30 thành 35 phút. Với chế độ rửa giải này (gradient 4), các vitamin B được tách ra khỏi nhau lần lượt trong khoảng thời gian lưu từ 13 đến 32 phút, các pic có độ đối xứng tốt và không xảy ra hiện tượng doãng chân pic. Chế độ rửa giải gradient 4 với chương trình thời gian và thành phần pha động như ở bảng 4.4 được xem là tối ưu nhất để tách các vitamin nhóm B ra khỏi nhau và giữ không đổi trong các lần khảo sát tiếp theo.
Bảng 4.4: Chương trình rửa giải gradient của pha động
Thời gian (phút) 0 , 0 1 1 3 15 19 23 25 27 35
% thể tích A 2 5 5 15 15 2 0 2 0 2 2
% thể tích B 98 95 95 85 85 80 80 98 98
4.1.3.2. Khảo sát ảnh hưởn2 của vH tới khả năne tách của hỗn hơp 5 vitamin B
Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm đến quá trình tách các vitamin đã được khảo sát bằng cách thay đổi các giá trị pH lần lượt 2,5; 2,7; 3 và 3,5. Thực nghiệm cho thấy, độ phân giải R giữa vitamin B2 và B6 tăng dần tương ứng là
1,84; 1,98; 2,24 và 2,69 (bảng 4.5). pH t R B6 ( p h ú t ) t R B2 ( p h ú t ) R 2,5 24.513 25.621 1,84 2,7 24.380 25.483 1.98 3,0 24.440 25.706 2.24 3,5 24.097 25.588 2.69