Phương tiện
Thời gian và địa điểm tiến hành:
- Phòng sinh hóa – khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng Dụng. -Thời gian: 5/2012 đến tháng 4/2013.
Vật liệu
- Giống lúa Huyết Rồng được lấy tại Viện nghiên cứu phát triển Đồng Bằng Sông Cửu Long. Đại Học Cần Thơ.
Hóa chất
- Thuốc thử Folin-Ciocalteu.
- Muối natri cacbonat (Na2CO3), muối Nhôm (III) clorua (AlCl3), nước cất. - Dimethyl sulphoxide (DMSO)
- Acid galic, quercetin.
- Methanol, etanol, acetone, hexan. - 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH).
Thiết bị và dụng cụ
- Máy đo quang phổ - Tủ sấy - Bình hút ẩm - Máy ly tâm - Ống nghiệm - Ống ly tâm - Pipette, micropipette - Ống đong, bình định mức, becher 3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.2.1 Khảo sát thành phần nguyên liệu
3.2.1.1 Xác định độ ẩm
Nguyên tắc: Sử dụng sức nóng để làm nước bốc hơi khỏi nguyên liệu. Sự chênh lệch về khối lượng mẫu trước và sau khi sấy chính là khối lượng nước có trong mẫu nguyên liệu.
Tiến hành: Sấy cốc cân sạch trong tủ sấy ở nhiệt độ 103 2oC đến trọng lượng không đổi, dùng cân phân tích cân xác định trọng lượng cốc cân mo(g).
Cân chính xác 0.5 – 1 g lúa hoặc bột gạo cho vào cốc, ghi nhận khối lượng (tổng lượng cốc cân và mẫu là m1). Tiến hành sấy ở nhiệt độ 103 2oC khoảng 3 giờ thì lấy cốc mẫu ra để nguội 15 phút trong bình hút ẩm. Cân cốc mẫu đã sấy và tiếp tục sấy khoảng 30 phút. Lập lại việc sấy và cân cho đến khi trọng lượng cốc mẫu giữa các lần sấy không thay đổi. Ghi nhận khối lượng m2(g).
Độ ẩm hạt được tính theo công thức:
100 0 1 2 1 m m m m W Trong đó: W: độ ẩm (%)
mo (g): Khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi m1 (g): Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy.
m2 (g): Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi
3.2.1.2 Xác định tỉ lệ gạo / lúa
Nguyên tắc: Hàm lượng chất cần ly trích chủ yếu chứa ở hạt gạo, nên khi tiến hành ly trích ta thực hiện trên hạt gạo, sau đó áp dụng tỉ lệ này để quy đổi hàm lượng về lúa.
Tiến hành: Cân 20 gam lúa, tiến hành bốc vỏ. Sau đó dùng cân để xác định khối lượng vỏ và khối lượng hạt gạo. Lập lại 5 lần lấy kết quả trung bình.
Tỉ lệ gạo/ lúa được tính theo:
100 % B A X Trong đó: X: Tỉ lệ gạo / lúa.
A: Khối lượng gạo đã bốc vỏ. B: Khối lượng lúa đem bốc vỏ.
3.2.1.3 Khảo sát khả năng quét gốc tự do
Nguyên tắc: Phương pháp thử DPPH thường được sử dụng cho việc khảo sát khả năng ức chế gốc tự do. Trong đó 2,2- Diphenyl-1-Picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do
điện tử N chưa ghép đôi. Chất có tác dụng chống oxi hóa sẽ làm giảm màu của DPPH. Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Hoạt tính quét gốc tự do của chất nghiên cứu tỉ lệ thuận với độ mất màu của DPPH. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm. [2]
Có thể mô tả phản ứng bằng phương trình sau:
O2N NO2 NO2 N O2N NO2 NH NO2 N N + AH + A DPPH DPPH-H Chuẩn bị mẫu:
Dung dịch DPPH:Pha dung dịch DPPH 0,008% trong metanol.
Cân 0,5 gam bột gạo cho vào ống nghiệm, thêm vào 4ml dung môi methanol. Cho ống nghiệm vào bể điều nhiệt có gắn hệ thống máy lắc và ổn định ở nhiệt độ khảo sát. Sau thời gian chiết tách, ly tâm ống nghiệm chứa mẫu chiết với tốc độ 5000 vòng/phút. Ly tâm trong vòng 10 phút. Mẫu Hóa chất 0 1 2 3 4 5 6 7 NĐ mẫu (mg/ml) 0 80 64 48 40 32 24 16 NĐ mẫu chiết 80 mg/ml (μl) 0 500 400 300 250 200 150 100 Metanol (μl) 500 0 100 200 250 300 350 400 DPPH 0,008% (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Các ống nghiệm được giữ trong tối, ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian 30 phút, tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 517 nm.
Tính toán:
% Hoạt tính ức chế DPPH của mẫu (IC) được tính theo công thức: % IC = [(A0 – Ax)*100/A0]
Ax là độ hấp thu của dung dịch DPPH khi nồng độ mẫu thử bằng x
3.2.1.4 Xây dựng đường chuẩn phân tích
Đường chuẩn acid galic xác định hàm lượng TPC
Nguyên tắc: Trong thành phần thuốc thử Folin-Ciocalteu có phức hợp molibden- tungsten. Phức hợp này sẽ bị khử bởi các hợp chất phenolic tạo thành sản phẩm phản ứng có màu xanh dương, hấp thụ cực đại ở bước sóng 765 nm. Hàm lượng polyphenol có trong mẫu tỉ lệ thuận với cường độ màu.
Tiến hành:
- Pha dãy dung dịch acid gallic chuẩn 0-0,5mg/ml và các hóa chất khác theo bảng 3.1. Tiến hành đo độ hấp phụ ở bước sóng 765 nm trên máy quang phổ UV-VIS Heliox α. Thí nghiệm được lập lại 2 lần lấy kết quả trung bình và vẽ đồ thị tương quan giữa nồng độ acid gallic và độ hập thu A
Bảng 3.1: Xây dựng đường chuẩn acid gallic
Mẫu Hóa chất 1 2 3 4 5 6 7 NĐ A.gallic (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 A.gallic 0,5 mg/ml (μl) 0 20 40 50 60 80 100 Nước cất (μl) 100 80 60 50 40 20 0 TT Folin 1N (μl) 400 400 400 400 400 400 400 Na2CO3 7,5%(ml) 1 1 1 1 1 1 1 Nước cất (ml) 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5
Cách tính kết quả: Dựa đồ thị biểu hiện sự tuyến tính giữa nồng độ acid gallic và độ hấp phụ A: A = Cx + y (với x, y là hệ số biểu hiện trên đồ thị).
Cách xác định hàm lượng polyphenol trong mẫu phân tích
Sử dụng phương pháp Folin-Ciocalteu. [25]
định trong vòng 5 phút, thêm vào 1ml dung dịch Na2CO3 7,5%, cuối cùng thêm nước cất vào hỗn hợp để đạt được thể tích 5ml. Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong vòng 2 giờ. Tiến hành đo mẫu bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 765nm.
Cách tính hàm lượng polyphenol
Hàm lượng TPC = (C*V*a)/m Trong đó:
TPC (mg GAE/g gạo): Hàm lượng TPC.
C (mg/ml): Dựa vào đường chuẩn acid gallic. A = Cx + y V (ml): Thể tích DMSO hòa tan cắn.
a: Hệ số pha loãng.
m (g): Khối lượng bột gạo đem chiết.
Đường chuẩn quercitin xác định hàm lượng TFC.
Nguyên tắc: Các hợp chất flavonoid tổng số có thể tạo phức màu với AlCl3 trong methanol được hấp thụ ở bước sóng 415 nm.
Tiến hành:
- Pha dãy dung dịch quercetin chuẩn 0-45 μg/ml. Cho lần lượt các hóa chất vào ống nghiệm theo bảng 3.2. Tiến hành đo độ hấp phụ ở bước sóng 415 nm trên máy quang phổ UV-Vis Heliox α. Thí nghiệm được lập lại 2 lần để lấy kết quả trung bình và vẽ đồ thị tương quan giữa nồng độ quercetin và độ hập thu A.
Bảng 3.2 : Xây dựng đường chuẩn quercetin
NĐ Quercetin (μg/ml) 0 5 15 25 35 45 TT Quercetin (μl) 0 50 150 250 350 450 MeOH (μl) 1000 950 850 750 650 550 AlCl3/MeOH (μl) 1000 1000 1000 1000 1000 1000
Cách xác định hàm lượng flavonoid trong mẫu phân tích [9]
Dịch chiết đem cô quay cho bay hết dung môi, hòa tan mẫu thu được trong DMSO. Hút 1000μl dịch chiết, thêm vào 1000 μl dung dịch MeOH/AlCl3 2% để ổn định khoảng 10 phút trong bóng tối. Sau đó, tiến hành đem đo quang ở bước sóng 415 nm, xác định độ hấp thu của mẫu.
Cách tính hàm lượng TFC:
Hàm lượng TFC = (C*V*a)/m Trong đó:
C (mg/ml): Dựa vào đường chuẩn quercetin. A = Cx + V (ml): Thể tích DMSO hòa tan cắn
a: Hệ số pha loãng
m (g): Khối lượng bột gạo đem chiết
3.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách đến hàm lượng polyphenol polyphenol
3.2.2.1 Mục đích
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ly trích hàm lượng polyphenol. Tìm được quy trình chiết tối ưu nhất. Từ quy trình chiết tối ưu trên, tiến hành phân tích hàm lượng TPC và TFC trên giống lúa huyết rồng nẩy mầm.
3.2.2.2 Bố trí thí nghiệm
Chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị bột gạo phân tích
Hạt lúa huyết rồng (lúa đỏ) mua về được xử lý loại bỏ tạp chất, phơi khô dưới ánh nắng mặt trời. Sau đó tách vỏ, nghiền thành bột bảo quản ở nhiệt độ (-5) – 0oC để sử dụng trong suốt quá trình thí nghiệm.
Quy trình chiết tách chung
Lúa Bóc vỏ Nghiền mịn Bột gạo
Chiết với dung môi
Dịch chiết
Hòa tan trong DMSO Mẫu Cô quay
Hình 3.1: Quy trình chiết các polyphenol trên lúa
Cân 0,5 gam bột gạo cho vào ống nghiệm, thêm dung môi và được thực hiện nhiều lần chiết. Cho ống nghiệm vào bể điều nhiệt có gắn hệ thống máy lắc và ổn định
Cặn Dung dịch
ở nhiệt độ khảo sát. Sau thời gian chiết tách, lọc dịch chiết bằng giấy lọc Watman số 2. Mẫu chiết đem cô quay, trữ lạnh và tiến hành đo mẫu theo mục 3.2.1.4
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Khảo sát loại dung môi thích hợp chiết tách hợp chất polyphenol
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố gồm 4 dung môi methanol, etanol, hexan, aceton. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Cân 0,5 gam bột gạo cho vào ống nghiệm, thêm vào 3ml lần lượt các dung môi khảo sát. Ngâm vào bể điều nhiệt ổn định có hệ thống lắc ở 40oC trong 3 giờ, tiến hành thu mẫu với 3 lần chiết. Sau đó tiến hành các bước tiếp theo như quy trình chiết tách chung
Đo hàm lượng polyphenol ở mỗi nghiệm thức dung môi khác nhau theo phương pháp của Rao. [25]
Thí nghiệm 2: Khảo sát lượng dung môi chiết tách hợp chất polyphenol tối ưu
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố với tỉ lệ mẫu/dung môi (đã chọn ở thí nghiệm 1) khác nhau là 1:4; 1:5, 1:6, 1:7 và 1:8 (w/v). Tiến hành thu mẫu với 3 lần chiết. Ngâm vào bể điều nhiệt ổn định ở 40oC trong 3 giờ cho mỗi lần chiết. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Thu mẫu và tiến hành các bước tiếp theo như quy trình chiết tách chung. Đo hàm lượng polyphenol theo phương pháp của Rao. [25]
Thí nghiệm 3: Khảo sát số lần chiết tách dung môi ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng số
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố với số lần chiết tách riêng biệt là 1, 2, 3 và 4 ở các nghiệm thức với thể tích dung môi đã chọn ở thí nghiệm 1 và 2. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Cân 0,5 gam bột gạo cho vào ống nghiệm, thêm vào 3ml dung môi được chọn. Ngâm vào bể điều nhiệt có hệ thống lắc ổn định ở nhiệt độ 40oC trong 3 giờ. Lọc lấy dịch riêng lẻ (được lần chiết thứ nhất), phần thô được cho lại vào từng ống nghiệm, tiếp tục thêm 3ml dung môi vào các ống nghiệm, chiết tương tự cộng dồn dịch chiết vào cùng 1 ống pi được lần chiết thứ 2, làm tương tự với các lần chiết thứ 3 và thứ 4. Thực hiện các nghiệm thức riêng biệt với số lần chiết 1, 2, 3 và 4. Thu mẫu và tiến hành các bước tiếp theo như quy trình chiết tách chung
Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết tách
Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với 1 nhân tố với các nhiệt độ khác nhau: 30 oC; 35oC; 40 oC; 45 oC; 50oC. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Tiến hành chiết tách với số lần đã chọn từ thí nghiệm 2 và thể tích dung môi đã chọn từ thí nghiệm 3. Ngâm vào các bể điều nhiệt ổn định ở các nhiệt độ khác nhau trong 3 giờ cho mỗi lần chiết. Thu mẫu và tiến hành các bước tiếp theo như quy trình chiết tách chung. Đo hàm lượng polyphenol theo phương pháp của Rao. [25]
Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng thời gian ly trích đến hàm lượng polyphenol tổng số
Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với 1 nhân tố với các mốc thời gian chiết tách là: 90; 150; 180; 210 và 270 phút.
Tiến hành chiết tách với số lần đã chọn từ thí nghiệm 2 và thể tích dung môi đã chọn từ thí nghiệm 3. Ngâm vào bể điều nhiệt ổn định ở nhiệt độ được chọn từ thí nghiệm 4 và các mốc thời gian khảo sát cho mỗi lần chiết. Thu mẫu và tiến hành các bước tiếp theo như quy trình chiết tách chung. Đo hàm lượng polyphenol theo phương pháp của Rao. [25]
3.2.3 Khảo sát hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số trong quá trình nẩy mầm từ giống lúa đỏ nẩy mầm từ giống lúa đỏ
3.2.3.1 Mục đích thí nghiệm:
Dựa vào các điều kiện chiết tách tối ưu từ mục 3.2.2 tiến hành khảo sát hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số trong quá trình nẩy mầm của giống lúa đỏ
3.2.3.2 Chuẩn bị lúa nẩy mầm.
- Chọn lọc những hạt lúa không bị sâu bệnh, làm sạch.
- Lúa giống được ngâm ngập với nước ấm pha với tỉ lệ 3 sôi 2 lạnh trong 1 ngày. Loại bỏ nước, gói khoảng 300 hạt vào khăn vải. Cho vào hộp nhựa tiến hành ủ trong điều kiện nhiệt độ 35oC trong tủ ủ. Quá trình nẩy mầm được ghi nhận từ ngày 0 (sau 24 giờ ngâm) là ngày đầu tiên tiến hành ủ cho đến ngày thứ 5.
3.2.3.3 Xác đinh hàm lượng TPC và TFC theo thời gian nẩy mầm
Hạt lúa nẩy mầm, đem bỏ phần vỏ, làm khô dưới ánh nắng mặt trời. Sau đó nghiền nát 50 hạt được mẫu phân tích. Tiến hành ly trích và xác định hàm lượng TPC theo quy trình sau:
Mẫu phân tích
Hình 3.2 Quy trình phân tích hàm lượng TPC và TFC 3.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu thu thập được tính giá trị trung bình các lần lặp lại, độ lệch chuẩn. Tất cả các số liệu đựơc xử lý trên excel và thống kê theo phần mềm Statgraphics XV, so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức bằng phương pháp ANOVA.
Dung môi Lọc Bả Dịch chiết Làm khô Pha loãng Phân tích TPC, TFC
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 THÀNH PHẦN NGUYÊN LIỆU
4.1.1. Độ ẩm và tỉ lệ gạo/lúa
Việc xác định độ ẩm hạt và tỉ lệ gạo trên lúa trong thí nghiệm được thực hiện nhằm mục đích quy đổi hàm lượng các chất (TPC hoặc TFC) từ bột mẫu nghiền phân tích sang hạt lúa nẩy mầm. Vì thế cần xác định chính xác yếu tố này. Kết quả thu được ở bảng 4.1
Bảng 4.1: Độ ẩm, tỉ lệ gạo/lúa
Chỉ tiêu phân tích Hàm lượng (%)
Độ ẩm lúa 10,83 Độ ẩm bột gạo 11,27 Tỉ lệ gạo/lúa 76,97
Kết quả trên cho thấy độ ẩm hạt lúa huyết rồng tiến hành thí nghiệm khá thấp do đây là lúa giống vì vậy mới có thể bảo quản trong thời gian dài. Tỉ lệ gạo/lúa đạt 76,97% tương đối khá thấp so với MTL-360 (81,4 %).
4.1.2 Khả năng quét gốc tự do của giống lúa huyết rồng
Để đánh giá khả năng chống oxy hóa của giống lúa huyết rồng, thí nghiệm tiến hành xác định theo phương pháp quét gốc tự do DPPH. Đây là phương pháp khá đơn giản, dễ thực hiện và mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxi hóa của mẫu nghiên cứu trong thử nghiệm ban đầu của nhà khoa học Aruna Prakash [8]. Trong đó giá trị IC được dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. IC50
được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. Kết quả cho ở bảng 4.2
Bảng 4.2: Khả năng quét gốc tự do giống lúa huyết rồng NĐ mẫu (mg/ml) A mẫu+DPPH % IC 0 0,794 0 16 0,654 17,63 24 0,588 25,94 32 0,515 35,14 40 0,441 44,46 48 0,374 52,90 64 0,283 64,36
80 0,104 86,90 IC50 45,25 mg/ml
Qua kết quả khảo sát ban đầu giống lúa huyết rồng cho thấy phần hàm lượng ức chế 50% gốc tự do khá thấp. Vì thế hoạt tính chống oxy hóa của giống lúa này khá cao. Điều này chứng tỏ một phần cơ sở khoa học trong việc ăn kiêng các loại gạo