Hạt lúa nẩy mầm, đem bỏ phần vỏ, làm khô dưới ánh nắng mặt trời. Sau đó nghiền nát 50 hạt được mẫu phân tích. Tiến hành ly trích và xác định hàm lượng TPC theo quy trình sau:
Mẫu phân tích
Hình 3.2 Quy trình phân tích hàm lượng TPC và TFC 3.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu thu thập được tính giá trị trung bình các lần lặp lại, độ lệch chuẩn. Tất cả các số liệu đựơc xử lý trên excel và thống kê theo phần mềm Statgraphics XV, so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức bằng phương pháp ANOVA.
Dung môi Lọc Bả Dịch chiết Làm khô Pha loãng Phân tích TPC, TFC
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 THÀNH PHẦN NGUYÊN LIỆU
4.1.1. Độ ẩm và tỉ lệ gạo/lúa
Việc xác định độ ẩm hạt và tỉ lệ gạo trên lúa trong thí nghiệm được thực hiện nhằm mục đích quy đổi hàm lượng các chất (TPC hoặc TFC) từ bột mẫu nghiền phân tích sang hạt lúa nẩy mầm. Vì thế cần xác định chính xác yếu tố này. Kết quả thu được ở bảng 4.1
Bảng 4.1: Độ ẩm, tỉ lệ gạo/lúa
Chỉ tiêu phân tích Hàm lượng (%)
Độ ẩm lúa 10,83 Độ ẩm bột gạo 11,27 Tỉ lệ gạo/lúa 76,97
Kết quả trên cho thấy độ ẩm hạt lúa huyết rồng tiến hành thí nghiệm khá thấp do đây là lúa giống vì vậy mới có thể bảo quản trong thời gian dài. Tỉ lệ gạo/lúa đạt 76,97% tương đối khá thấp so với MTL-360 (81,4 %).
4.1.2 Khả năng quét gốc tự do của giống lúa huyết rồng
Để đánh giá khả năng chống oxy hóa của giống lúa huyết rồng, thí nghiệm tiến hành xác định theo phương pháp quét gốc tự do DPPH. Đây là phương pháp khá đơn giản, dễ thực hiện và mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxi hóa của mẫu nghiên cứu trong thử nghiệm ban đầu của nhà khoa học Aruna Prakash [8]. Trong đó giá trị IC được dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. IC50
được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. Kết quả cho ở bảng 4.2
Bảng 4.2: Khả năng quét gốc tự do giống lúa huyết rồng NĐ mẫu (mg/ml) A mẫu+DPPH % IC 0 0,794 0 16 0,654 17,63 24 0,588 25,94 32 0,515 35,14 40 0,441 44,46 48 0,374 52,90 64 0,283 64,36
80 0,104 86,90 IC50 45,25 mg/ml
Qua kết quả khảo sát ban đầu giống lúa huyết rồng cho thấy phần hàm lượng ức chế 50% gốc tự do khá thấp. Vì thế hoạt tính chống oxy hóa của giống lúa này khá cao. Điều này chứng tỏ một phần cơ sở khoa học trong việc ăn kiêng các loại gạo huyết rồng và để trị bệnh trong dân gian.
4.1.3 Kết quả các đường chuẩn
Đường chuẩn acid gallic
Hình 4.1. Đường chuẩn acid gallic
Dựa vào đồ thị nhận thấy khoảng nồng độ từ 0,1-0,5 mg/ml có sự tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ A. So sánh hệ số tương quan R của đồ thị và giới hạn tương quan ta thấy 0,9 < R = 0,999 < 1. Do đó, có thể dùng phương trình hồi quy A = 2,2319.C + 0,0539 để tiến hành xác định hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) trong mẫu phân tích.
Hình 4.2: Đường chuẩn quercetin
Dựa vào đồ thị nhận thấy khoảng nồng độ từ 5-45 μg/ml có sự tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ A. So sánh hệ số tương quan R của đồ thị và giới hạn tương quan ta lại thấy 0,9 < R = 0,999 < 1. Do đó, có thể dùng phương trình hồi quy A = 0,0255.C + 0,0081 để tiến hành xác định hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) trong mẫu phân tích.
4.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chiết tách hàm lượng polyphenol tổng số lượng polyphenol tổng số
4.2.1 Loại dung môi thích hợp chiết tách hợp chất polyphenol
Thí nghiệm được tiến hành chiết tách ở nhiệt độ 40oC, thời gian 180 phút và với 3 lần chiết cho từng loại dung môi khác nhau. Kết quả được xử lý thống kê cho ở bảng 4.3
Bảng 4.3: Hàm lượng TPC thu nhận với dung môi chiết tách khác nhau
Dung môi chiết (ml)
Hàm lượng TPC* (mg GAE/100g lúa) Aceton 28,077 0,441a Metanol 45,253 1,085b Etanol 31,113 0,886c Hexan 1,937 0,613d
(*Kết quả được tính trên % vật chất lúa khô)
(Các giá trị trong cùng một cột có cùng chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05))
Từ kết quả bảng 4.1 nhận thấy khi chiết tách với các dung môi khác nhau thì khả năng thu nhận hàm lượng polyphenol tổng số khác nhau. Hàm lượng TPC khi chiết với
dung môi metanol cho hiệu quả cao nhất (45,253 mg GAE/100g lúa) và thấp nhất tương ứng với dung môi hexan (1,937 mg GAE/100g lúa). Điều này có thể giải thích do các dung môi phân cực như methanol và etanol có độ phân cực cao hơn hexan và aceton nên dễ dàng xâm nhập phá vỡ cấu trúc tế bào của bột và tách chiết được hầu như tối đa các hợp chất polyphenol có tính phân cực khá cao tồn tại trong hạt. Kết quả này cũng phù hợp với một số nghiên cứu chiết tách hợp chất polyphenol tổng số của các nghiên cứu trên cám gạo hoặc hạt nẩy mầm và các loại lá thuốc đã được làm khô cũng được chiết từ dung môi metanol 100%. [25], [7]
Do có thể sử dụng dung môi methanol để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng khác.
4.2.2 Khảo sát lượng dung môi ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng số thu nhận số thu nhận
Các hợp chất polyphenol rất đa dạng với hàm lượng nhiều hay ít khác nhau tùy theo nguồn gốc nguyên liệu thu nhận. Vì thế chiết tách với lượng dung môi thích hợp để chiết rút hết lượng polyphenol có trong mẫu phân tích là điều cần thiết. Thí nghiệm được tiến hành chiết tách mẫu ở các tỉ lệ mẫu : dung môi metanol khác nhau ở các nghiệm thức, làm khô mẫu, phân tích và ghi nhận kết quả ở bảng 4.4:
Bảng 4.4: Hàm lượng TPC thu nhận với tỉ lệ dung môi chiết tách khác nhau Tỉ lệ mẫu/ MeOH (w/v) Hàm lượng TPC* (mg GAE/100g lúa) 1:4 43,273 0,387b 1:5 43,604 1,906b 1:6 45,453 0,756a 1:7 42,853 0,260b 1:8 42,826 0,765b
(*Kết quả được tính trên % vật chất lúa khô)
(Các giá trị trong cùng một cột có cùng chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05))
Từ kết quả bảng 4.4 cho thấy khi tăng lượng dung môi lên thì hiệu quả chiết tách các hợp chất polyphenol tăng rõ rệt. Kết qủa này có thể do lượng dung môi càng nhiều tạo được sự chênh lệch cần thiết bên trong và bên ngoài môi trường do đó quá trình chiết tách được diễn ra liên tục nên các chất hòa tan được trong dung môi sẽ tốt hơn. Tuy nhiên với tỉ lệ mẫu và dung môi 1:7 và 1:8 có hiệu quả trích ly hợp chất polyphenol thấp hơn các tỉ lệ khác có thể do nó là chất chống oxy hóa nên sử dụng lượng dung môi quá nhiều ảnh hưởng đến các giai đoạn cô mẫu vì thời gian làm khô mẫu phải kéo dài.
Kết quả thống kê cho thấy ở tỉ lệ mẫu và dung môi 1:6 thì hàm lượng TPC thu được cao nhất và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Kết quả cũng phù hợp khi nghiên cứu các loại lá cây dược liệu sấy khô có nguồn gốc từ Malaysia được chiết tách các hợp chất chống oxy hóa với tỉ lệ mẫu: dung môi metanol là 1:6 [20]. Trên thực tế với khối lượng mẫu khảo sát như trên phải dùng lượng dung môi vừa đủ giúp bột gạo khuếch tán vào dung môi để diện tích tiếp xúc là lớn nhất thì hiệu suất chiết sẽ tốt nhất. Không nên dùng quá nhiều gây hao phí dung môi, ảnh hưởng cho giai đoạn cô mẫu tiếp theo, mặc khác sẽ không có lợi về mặt kinh tế và môi trường.
Do đó tỉ lệ nguyên liệu mẫu : dung môi (w/v) 1:6 được chọn để khảo sát các yếu tố tiếp theo.
4.2.3. Khảo sát số lần chiết tách dung môi ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng số
Việc chiết tách các hợp chất polyphenol ngoài tỉ lệ mẫu: dung môi cho mỗi lần chiết còn nhận thấy số lần chiết trên 1 mẫu phân tích có ảnh hưởng đến hàm lượng thu nhận được. Vì thế trong thí nghiệm tiến hành với số lần chiết khác nhau trên cùng tỉ lệ mẫu : dung môi là 1:6 ở các nghiệm thức. Kết quả cho ở bảng 4.5
Bảng 4.5. Hàm lượng TPC thu được với số lần chiết tách khác nhau Số lần chiết (ml) Hàm lượng TPC* (mg GAE/100g lúa) Chiết 1 lần 27,354 1,155a Chiết 2 lần 36,503 1,272b Chiết 3 lần 45,108 0,174c Chiết 4 lần 43,749 0,806c
(*Kết quả được tính trên % vật chất lúa khô)
(Các giá trị trong cùng một cột có cùng chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05))
Kết quả cho thấy hiệu quả thu nhận hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất khi thực hiện từ 3-4 lần. Điều này được giải thíchkhi dung môi tấn công vào cấu trúc của hạt cần một khoảng thời gian nhất định để các chất hòa tan được lôi kéo khỏi tế bào. Việc chiết nhiều lần sẽ gia tăng thêm thời gian dung môi tiếp xúc với chất tan tạo điều kiện chiết tách cạn kiệt hơn chất cần phân tích. Tuy nhiên trên thực tế, do chất đang khảo sát là hợp chất chống oxy hóa, chúng rất dễ bị oxi hóa nên việc chiết nhiều lần có thể ảnh hưởng đến hàm lượng thu được.
Do đó, để đạt được hiệu quả ly trích là tốt nhất thực hiện 3 lần chiết là tối ưu. Kết quả này phù hợp với các khảo sát trên cám gạo hoặc hạt nẩy mầm và các loại lá thuốc đã được làm khô, cũng tiến hành chiết tách ít nhất 3 lần với cùng lượng dung môi.
4.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết tách polyphenol
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sự hòa tan các chất cần chiết tách trong một dung môi thích hợp. Vì vậy trong thí nghiệm này tiến hành ly trích mẫu ở các nhiệt độ khác nhau và kết quả nhận được ở bảng 4.6
Bảng 4.6: Hàm lượng TPC thu nhận với các nhiệt độ chiết tách khác nhau Nhiệt độ chiết (oC) Hàm lượng TPC*
(mg GAE/100g lúa) 30 37,908 0,378a 35 42,853 0,569b 40 45,224 1,129c 45 41,262 0,305d 50 37,764 0,181a
(*Kết quả được tính trên % vật chất lúa khô)
(Các giá trị trong cùng một cột có cùng chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05))
Hàm lượng polyphenol thu nhận được gia tăng khi tiến hành khảo sát ở nhiệt độ từ 30-40oC và bắt đầu giảm khi tiến hành ở nhiệt độ trên 40oC. Kết quả có thể giải thích khi nhiệt độ tăng sự phá hủy màng tế bào thực vật của dung môi sẽ dễ dàng và các chất hòa tan trong dung môi sẽ tốt hơn nên hiệu quả quá trình chiết tách cũng tăng theo. Mặc khác các hợp chống oxy hóa thường kém bền bởi nhiệt, chúng dễ bị oxy hóa ở nhiệt độ quá cao, cấu trúc của chúng có thể bị phá hủy. Ở nhiệt độ 50oC có thể làm dung môi dễ bị bay hơi nên cũng ảnh hưởng đến quá trình chiết tách. Vì vậy ở nhiệt độ 45-50oC hàm lượng polyphenol thu được thấp hơn các nhiệt đô 35-40oC.
Như vậy thí nghiệm cho thấy ở nhiệt độ 40oC cho hiệu quả chiết tách các hợp chất polyphenol từ giống lúa huyết rồng đạt hiệu suất cao nhất.
4.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ly trích đến hàm lượng polyphenol
Sau yếu tố nhiệt độ thì thời gian chiết tách cũng ảnh hưởng nhiều đến khả năng chiết tách các hợp chất cần phân tích.Trong thí nghiệm tiến hành ổn định các yếu tố khác và thay đổi thời gian chiết tách mẫu ở các thời điểm khác nhau. Kết quả thể hiện ở bảng 4.7
Bảng 4.7: Hàm lượng TPC thu nhận với các thời gian ly trích khác nhau Thời gian chiết
(phút) Hàm lượng TPC* (mg GAE/100g lúa) 90 32,993 0,639a 150 35,826 1,655b 180 45,311 0,900c
210 40,829 0,856d 270 40,337 0,694d
(*Kết quả được tính trên % vật chất lúa khô)
(Các giá trị trong cùng một cột có cùng chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05))
Từ số liệu thực nghiệm cho thấy khi tăng dần thời gian chiết thì hàm lượng TPC thu được càng tăng và đạt cao nhất khi thực hiện chiết ở 180 phút và có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức khác. Khi thực hiện chiết tách với thời gian càng dài cùng với các điều kiện chiết tách phù hợp thì hiệu quả của quá trình chiết tách càng cao. Tuy nhiên, thực hiện chiết tách hợp chất chống oxy hóa nên việc kéo dài thời gian chiết 210-270 phút có thể làm giảm hàm lượng polyphenol tổng số.
Sau khi thực hiện khảo sát mục 4.2.4 và 4.2.5 chúng tôi cũng tiến hành bố trí thí nghiệm tương tác giữa 2 yếu tố quan trọng trong quá trình chiết tách là nhiệt độ và thời gian. Với yếu tố nhiệt độ lấy 3 mức độ là 35; 40 và 45oC và mức độ thời gian là 150, 180 và 210 phút. Tiến hành thí nghiệm với 9 nghiệm thức và 3 lần lặp lại nhưng kết quả thống kê không thấy sự tương tác giữa hai yếu tố này. Vì thế kết quả được phép không trình bày trong luận văn này.
Tóm lại: Từ kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chiết tách hàm lượng polypheol tổng số trong giống lúa huyết rồng chúng tôi sẽ chọn điều kiện ly trích tốt nhất bảng 4.8 để tiến hành chiết tách các hợp chất polyphenol khi thực hiện thí nghiệm nẩy mầm giống lúa này theo thời gian.
Bảng 4.8: Điều kiện ly trích tối ưu các hợp chất polyphenol
Dung môi Metanol Số lần chiết (lần) 3 Tỉ lệ dung môi 1:6 Thời gian chiết (phút) 180 Nhiệt độ chiết 40oC
4.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG POLYPHENOL VÀ
FLAVONOID TỔNG SỐ TRONG QUÁ TRÌNH NẢY MẦM GIỐNG LÚA HUYẾT RỒNG
Dựa trên các điều kiện ly trích tối ưu hàm lượng hợp chất phenol tống số đã khảo sát ở phần 4.2, tiến hành khảo sát hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) và flavonoid tổng số (TFC) theo thời gian nẩy mầm của giống lúa huyêt rồng. Kết quả nhận được ở bảng 4.9
Bảng 4.9: Hàm lượng TPC và TFC theo các giai đoạn nẩy mầm Ngày nẩy mầm Hàm lượng TPC *
(mg GAE/100g ) Hàm lượng TFC* (mg QE/100g) Chuẩn 25,980 0,989a 4,077 0,260a 0 27,476 1,239a 4,366 0,478a 1 33,165 0,567b 5,754 0,478b 2 35,597 0,425c 5,610 0,361b 3 38,113 0,193d 2.747 0.100c 4 66,785 0,800e 3,036 0,174c 5 49,726 1,529f 3,065 0,05c
(*Kết quả được tính trên % vật chất lúa khô)
(Các giá trị trong cùng một cột có cùng chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05))
Dựa vào kết quả bảng 4.9 nhận thấy hàm lượng TPC tăng dần theo thời gian nẩy mầm. Hàm lượng TPC đạt cực đại vào ngày thứ 4 của giai đoạn nẩy mầm (66,8 mg GAE/100g lúa), sau đó có xu hướng giảm xuống vào ngày nẩy nầm thứ 5. Kết quả này cũng tương tự như nghiên cứu của hai nhà khoa học A. Moongngarm và E. Khomphiphatkul khảo sát trên giống lúa nâu của Thái lan hàm lượng TPC cũng tăng dần trong 5 ngày đầu nẩy mầm hạt. [7]
Đối với hàm lượng flavonid tổng số cũng có tăng trong 2 ngày đầu tiên sau khi ủ hạt, đạt cao nhất vào ngày thứ nhất nẩy mầm (5,75 mg QE/100g lúa), sau đó giảm dần vào những ngày tiếp theo.
Hàm lượng các hợp chất polyphenol tổng số tăng lên trong quá trình nẩy mầm được giải thích khi hạt chưa nẩy mầm các chất dinh dưỡng ở dạng hợp chất cao phân tử không hòa tan. Khi gặp điều kiện thuận lợi, hạt hút nước và quá trình thủy phân xảy ra làm phá vỡ các vách tế bào trong suốt tiến trình hạt nẩy mầm. Điều này dẫn đến việc gia tăng các hợp chất phenol ở dạng tự do. Ngoài ra, việc sinh tổng hợp các hợp các chất chống oxy hóa khác đặc biệt nhóm vitamin E cũng xảy ra đồng thời trong giai đoạn nẩy mầm hạt. Vì thế hạt nẩy mầm ngoài các hợp chất polyphenol tổng số thì hàm lượng các chất chống oxi hóa khác đều cao hơn hơn so với hạt chưa nẩy mầm. [11], [24].
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN
1. Đề tài nghiên cứu đã tìm ra điều kiện ly trích hàm lượng polyphenol tổng số trong giống lúa huyết rồng thu được hiệu quả cao khi sử dụng tỉ lệ mẫu : metanol là
1:6, qua 3 lần chiết ở nhiệt độ 40oC trong thời gian 180 phút đạt khoảng 45,11 – 45,45
mg GAE/100g lúa.
2. Trong thời gian nẩy mầm giống lúa huyết rồng, hàm lượng poplyphenol tổng số tăng dần theo thời gian và đạt cực đại vào ngày thứ 4 (66,78 mg GAE/100g lúa), sau đó có xu hướng giảm xuống vào ngày nẩy nầm thứ 5. Hàm lượng flavonid tổng số tăng trong 2 ngày đầu tiên sau khi ủ hạt, đạt cao nhất vào ngày thứ nhất nẩy mầm (5,75 mg QE/100g lúa)
Kết quả đề tài làm cơ sở nghiên cứu tiếp theo về các hoạt chất chống oxy hóa