Cà chua hồng Đà Lạt, chín hoàn toàn, nguyên vẹn, không bị dập nát, hƣ thối, có màu đỏ đẹp, thuận lợi trong việc chà thu nhận pure cà chua, vỏ trái sẽ tách ra dễ dàng.
Đƣờng kính trắng tinh luyện (RE) của công ty đƣờng Biên Hòa.
Muối ăn NaCl tinh khiết không có chứa Iot của Liên Hiệp HTX Thƣơng mại TPHCM.
28 2.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.2.1 Trình tự thí nghiệm Hình 2.1 Sơ đồ trình tự thí nghiệm. Khảo sát Bifidobacterium bifidum
Xử lí nguyên liệu cà chua.
Khảo sát
các điều kiện lên men
Đánh giá chất lƣợng sản phẩm
Tạo sản phẩm nƣớc cà chua bổ sung probiotic
29
2.2.2 Các nội dung thí nghiệm
2.2.2.1 Xử lí giống
a. Quan sát vi thể, đại thể:
Cấy ria qua môi trƣờng MRS thạch đĩa để kiểm tra độ thuần của giống, chọn khuẩn lạc đặc trƣng, quan sát đại thể, vi thể và xác định Gram bằng phƣơng pháp nhuộm Gram.
Chọn khuẩn lạc đặc trƣng cấy chuyền giống vào môi trƣờng MRS thạch nghiêng để giữ giống.
Cấy chuyền vào môi trƣờng MRS lỏng, tăng sinh giống sau 24-48 giờ nuôi cấy, thu đƣợc sinh khối tốt. Nhân giống cấp 2 để chuẩn bị lên men. b. Môi trƣờng giống trung gian cho dịch lên men cà chua.
Do mùi và vị rất khác biệt của môi trƣờng MRS, ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm cuối cùng nên sau khi tăng sinh giống trên môi trƣờng MRS, giống đƣợc chuyển qua môi trƣờng trung gian sữa gầy (3%). Sau một thời gian nuôi cấy, cấy giống vào môi trƣờng lên men cà chua. Khảo sát số lƣợng vi khuẩn Bifidobacterium bifidum phát triển trên môi
trƣờng sữa gầy bằng phƣơng pháp trải đĩa đếm số khuẩn lạc.
2.2.3 Khảo sát qui trình tạo sản phẩm.
Dựa vào một số qui trình tạo sản phẩm đồ uống lên men lactic, qui trình tạo sản phẩm cà chua probiotic theo sơ đồ hình 2.2.
Cà chua nguyên liệu đƣợc xử lí sơ bộ, sau đó chần trong nƣớc nóng, tiến hành chà, và lọc thu nhận pure cà chua. Pure thu đƣợc sau khi chà có dạng huyền phù, phần thịt của quả có kích thƣớc lớn nên nhanh chóng bị phân lớp, sau khi phối trộn với đƣờng và muối ăn, tiến hành đồng hóa dịch để tăng độ đồng nhất cho dịch lên men. Dịch pure đƣợc thanh trùng ở 90 – 95oC trong 5 phút để tiêu diệt vi sinh vật. Sau đó tiến hành lên men với tác nhân Bifidobacterium bifidum.
30 Phối trộn Đồng hóa Cà chua Rửa sạch Chần nƣớc nóng Chà Lọc Pure Lên men Sản phẩm Vỏ, Hạt Thanh trùng 90 – 95 o C, 5 phút Bifidobacterium bifidum
31
Chọn tỉ lệ hỗn hợp giống cho quá trình lên men là 5%. Về nguyên tắc, lƣợng giống lên men sử dụng càng lớn thì lên men nhanh, rút ngắn thời gian lên men, giảm nguy cơ tạp nhiễm, sinh khối probiotic tính trên đơn vị sản phẩm tăng. So với tỉ lệ giống cấy thƣờng sử dụng trong lên men là 3 - 5% thì 5% là khá cao và có thể chấp nhận đƣợc. Hơn nữa, để đạt mức tiêu thụ sản phẩm hiệu quả về mật độ probiotic cao có thể bổ sung probiotic sau lên men.
Chọn nhiệt độ cho quá trình lên men là 37oC, vì giống sử dụng cho quá trình lên men là những vi sinh vật ƣa ấm. Sản phẩm định hƣớng là probiotic do đó 37oC là nhiệt độ lí tƣởng để sản phẩm vẫn tiếp tục phát huy hoạt lực probiotic khi vào trong cơ thể ngƣời sử dụng.
Thực hiện quá trình khảo sát chế độ chần cà chua ở các nhiệt độ 70oC, 80 oC, 90oC trong 1, 2, 3 phút. Chọn chế độ chần tối ƣu nhất có hiệu suất thu nhận pure cao (tỉ lệ khối lƣợng pure thu đƣợc so với khối lƣợng trái đem chà (%))
2.2.4 Khảo sát điều kiện lên men.
Tiến hành lên men trong 24h, dựa trên các chỉ tiêu pH, lƣợng acid lactic (%), nồng độ chất khô hòa tan (độ Brix %), khảo sát các ảnh hƣởng của các yếu tố:
Hàm lƣợng đƣờng sucrose thích hợp bổ sung vào dịch cà chua lên men. Tỉ lệ giống vi sinh vật ban đầu cấy vào dịch lên men.
Nhiệt độ, pH thích hợp cho dịch cà chua lên men.
Khảo sát pha loãng nƣớc ép cà chua trƣớc khi lên men để chọn tỉ lệ pha loãng phù hợp với thị hiếu ngƣời tiêu dùng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khảo sát hàm lƣợng muối bổ sung vào nƣớc ép cà chua trƣớc lên men tạo vị cho sản phẩm, nâng cao chất lƣợng cảm quan sản phẩm.
2.2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường sucrose đến quá trình lên men và chất lượng sản phẩm.
a. Mục đích: Chọn ra hàm lƣợng đƣờng sucrose tối ƣu cho quá trình lên men và chất lƣợng cảm quan sản phẩm.
32 Tỉ lệ sucrose (g/100ml) 5 7 10 13 15 17 20 25 Nghiệm thức M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 Nƣớc ép cà chua (hiệu chỉnh pH 5) Cấy giống 5 %
Lên men ( 37oC, 24giờ)
Bảo quản (4- 6oC)
Hình 2.1. Sơ đồ khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng sucrose c. Phƣơng pháp thực hiện:
Thực hiện chế độ chần tối ƣu thu nhận dịch pure cà chua. Nguyên vật liệu đƣợc chuẩn bị nhƣ trên sơ đồ qui trình thành 8 mẫu (mỗi mẫu 100ml), mỗi thí nghiệm đƣợc tiến hành theo sơ đồ trên ở nhiệt độ 37oC. Tuy nhiên, hàm lƣợng đƣờng sucrose bổ sung đƣợc thay đổi theo nghiệm thức nhƣ trên.
d. Các chỉ tiêu theo dõi: Thông số pH, hàm lƣợng acid lactic (%), hàm lƣợng chất khô hòa tan (Brix %), tiến hành đánh giá và cảm quan sơ bộ.
2.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy ban đầu đến quá trình lên men và chất lượng sản phẩm
a. Mục đích: Chọn ra tỉ lệ cấy giống tối ƣu cho quá trình lên men. b. Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Khảo sát một yếu tố: tỉ lệ cấy giống
33 Tỉ lệ cấy giống (ml/100ml) 3 5 7 9 11 Nghiệm thức M1 M2 M3 M4 M5 Nƣớc cà chua ép (hiệu chỉnh pH 5) Cấy giống
Lên men (37oC, 24 giờ)
Bảo quản (4-6o C)
Hình 2.2. Sơ đồ khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ giống cấy. c. Phƣơng pháp thực hiện:
Nguyên vật liệu đƣợc chuẩn bị nhƣ trên sơ đồ qui trình thành 4 mẫu (mỗi mẫu 100ml), mỗi thí nghiệm đƣợc tiến hành theo sơ đồ trên ở nhiệt độ 37o
C. Tuy nhiên, tỉ lệ giống cấy đƣợc thay đổi theo các nghiệm thức nhƣ trên.
d. Chỉ tiêu theo dõi:
Thông số pH, hàm lƣợng acid lactic (%), hàm lƣợng chất khô hòa tan (Brix %), tiến hành đánh giá và cảm quan sơ bộ.
2.2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men:
a. Mục đích: xác định thời gian lên men thích hợp để sản phẩm đạt chất lƣợng tốt nhất.
b. Sơ đồ bố trí thí nghiệm: khảo sát một yếu tố: thời gian lên men.
Thời gian lên men (giờ) 24 36 48 60 72
Nghiệm thức M1 M2 M3 M4 M5
M3
34
Nƣớc ép cà chua ( hiệu chỉnh pH 5)
Cấy giống (theo tỉ lệ tối ƣu)
Lên men ( 37O C) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảo quản (4-6o C)
Hình 2.3. Sơ đồ khảo sát ảnh hƣởng của thời gian lên men. c. Phƣơng pháp thực hiện:
Thực hiện chế độ chần tối ƣu thu nhận dịch pure cà chua. Nguyên vật liệu đƣợc chuẩn bị nhƣ trên sơ đồ qui trình, mẫu đƣợc chuẩn bị thành 5 mẫu (mỗi mẫu 100ml), mỗi thí nghiệm đƣợc tiến hành theo sơ đồ trên ở nhiệt độ 37o
C. Tuy nhiên, thời gian lên men đƣợc thay đổi theo nghiệm thức nhƣ trên.
d. Chỉ tiêu theo dõi:
Theo dõi chỉ tiêu: số lƣợng vi khuẩn lactic Bifidobacteria bifidum, thông số pH, hàm lƣợng acid lactic (%), hàm lƣợng chất khô hòa tan (Brix %), tiến hành đánh giá và cảm quan sơ bộ.
2.2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men và chất lượng sản phẩm.
a. Mục đích: Chọn ra nhiệt độ tối ƣu cho quá trình lên men. b. Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Nhiệt độ (oC) 28 37 40 45 Nghiệm thức M1 M2 M3 M4
35
Nƣớc ép cà chua (hiệu chỉnh pH 5)
Cấy giống (tỉ lệ tối ƣu)
Lên men ( thời gian tối ƣu)
Bảo quản (4- 6oC)
Hình 2.4. Sơ đồ khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ. c. Phƣơng pháp thực hiện:
Nguyên vật liệu đƣợc chuẩn bị nhƣ trên sơ đồ qui trình thành 4 mẫu (mỗi mẫu 100ml), mỗi thí nghiệm đƣợc tiến hành theo sơ đồ trên ở các điều kiện tối ƣu đã khảo sát một phần. Tuy nhiên, nhiệt độ lên men đƣợc thay đổi theo nghiệm thức 28o
C, 37oC, 40oC, 45oC.
d. Theo dõi chỉ tiêu: số lƣợng vi khuẩn lactic Bifidobacteria bifidum, thông số pH, hàm lƣợng acid lactic (%), nồng độ chất khô hòa tan (Brix %), tiến hành đánh giá và cảm quan sơ bộ.
2.2.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men và chất lượng sản phẩm.
a. Mục đích: Chọn ra pH thích hợp cho quá trình lên men. b. Sơ đồ bố trí thí nghiệm: thí nghiệm một yếu tố pH.
pH Không kiểm
soát pH 4.5 5 5.5
Nghiệm thức M1 M2 M3 M4
36
Nƣớc ép cà chua
Cấy giống ( tỉ lệ tối ƣu)
Lên men ( thời gian tối ƣu, nhiệt độ tối ƣu)
Bảo quản (4- 6oC)
Hình 2.5. Sơ đồ khảo sát ảnh hƣởng của pH c. Phƣơng pháp thực hiện: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyên vật liệu đƣợc chuẩn bị nhƣ trên sơ đồ qui trình thành 4 mẫu (mỗi mẫu 100ml), mỗi thí nghiệm đƣợc tiến hành theo sơ đồ trên ở điều kiên tối ƣu đã đƣợc khảo sát. Tuy nhiên, pH đƣợc thay đổi theo nghiệm thức 4.5, 5, 5.5, và không kiểm soát pH.
d. Theo dõi chỉ tiêu:
Số lƣợng vi khuẩn lactic Bifidobacteria bifidum, thông số pH, hàm lƣợng acid lactic (%), nồng độ chất khô hòa tan (Brix %), đánh giá và tiến hành cảm quan sơ bộ.
2.2.4.6 Khảo sát tỉ lệ pha loãng nước ép cà chua trước khi lên men
a. Mục đích: Chọn ra tỉ lệ pha loãng thích hợp cho quá trình lên men nâng cao chất lƣợng cảm quan của sản phẩm.
b. Sơ đồ bố trí thí nghiệm: thí nghiệm một yếu tố: tỉ lệ pha loãng.
Tỉ lệ pha loãng
(nƣớc cà chua ép : nƣớc tiệt trùng) 1 : 0 1 : 1 2: 1
Nghiệm thức M1 M2 M3
37
Nƣớc ép cà chua ( hiệu chỉnh pH tối ƣu)
Cấy giống( tỉ lệ tối ƣu)
Lên men (nhiệt độ tối ƣu, thời gian tối ƣu)
Bảo quản (4-6oC)
Hình 2.6. Sơ đồ khảo sát ảnh hƣởng của pha loãng trƣớc lên men. c. Phƣơng pháp thực hiện:
Nguyên vật liệu đƣợc chuẩn bị nhƣ trên sơ đồ qui trình, các mẫu đƣợc tiến hành pha loãng với các nghiệm thức nhƣ trên. Mỗi thí nghiệm đƣợc tiến hành ở các điều kiện tối ƣu đã đƣợc khảo sát.
d. Chỉ tiêu theo dõi:
Số lƣợng vi khuẩn lactic Bifidobacteria bifidum, thông số pH, hàm lƣợng acid lactic (%), hàm lƣợng chất khô hòa tan (Brix %), tiến hành đánh giá và cảm quan sơ bộ.
2.2.4.7 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng muối đến quá trình lên men và chất lượng sản phẩm
a. Mục đích: Chọn ra hàm lƣợng muối thích hợp tạo vị ngon cho sản phẩm. b. Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Khảo sát yếu tố hàm lƣợng muối.
38
Tỉ lệ muối (g/100ml) 0 0.1 0.2 0.3
Nghiệm thức M1 M2 M3 M4
Nƣớc ép cà chua (hiệu chỉnh pH tối ƣu)
Cấy giống ( tỉ lệ tối ƣu)
Lên men (nhiệt độ, thời gian tối ƣu)
Bảo quản (4-6o C)
Hình 2.7. Sơ đồ khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ muối. c. Phƣơng pháp thực hiện: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyên vật liệu đƣợc chuẩn bị nhƣ trên sơ đồ qui trình thành 4 mẫu (mỗi mẫu 100ml). Mẫu đƣợc tiến hành lên men với các điều kiện tối ƣu đã khảo sát đƣợc. Tuy nhiên hàm lƣợng muối bổ sung đƣợc thay đổi theo nghiệm thức 0g/100ml, 0.1g/100ml, 0.2g/100ml, 0.3g/100ml dịch lên men.
d. Chỉ tiêu theo dõi:
Thông số pH, hàm lƣợng acid lactic (%), nồng độ chất khô hòa tan (Brix %), tiến hành đánh giá và cảm quan sơ bộ.
2.2.4 Khảo sát và đánh giá chất lƣợng sản phẩm.
Các chỉ tiêu pH, nồng độ chất khô hòa tan, hàm lƣợng acid lactic, số lƣợng vi khuẩn lactic đƣợc đánh giá trong suốt quá trình lên men và sau quá trình lên men tạo sản phẩm. Tiến hành lên men với các thông số điều kiện tối ƣu đã khảo sát. Tiến hành khảo sát hoạt tính probiotic theo thời gian bảo quản. Sản phẩm đƣợc tạo trong điều kiện lên men tối ƣu sẽ đƣợc bảo quản ở 4oC – 6oC và tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu
39
pH, số lƣợng vi khuẩn probiotic (cfu/ml) tại thời điểm 0 (lúc sản phẩm mới tạo) và các tuần lễ liên tiếp sau đó.
2.2.4.1 Khảo sát chỉ tiêu cảm quan.
a. Mục đích:
Đánh giá mức chất lƣợng của sản phẩm trên tất cả các chỉ tiêu cảm quan màu, mùi vị, cấu trúc. Tình trạng chất lƣợng của mỗi chỉ tiêu đƣợc đánh giá bằng điểm.
b. Nguyên tắc:
Phép thử cho điểm chất lƣợng đƣợc thực hiện theo TCVN 3215-79. Đây là tiêu chuẩn xây dựng trên một thang thống nhất 6 bậc 5 điểm. Điểm 0 ứng với chất lƣợng sản phẩm “bị hỏng”, còn từ điểm 1 đến điểm 5 ứng với mức khuyết tật giảm dần, ở điểm 5, sản phẩm coi nhƣ không bị lỗi và khuyết tật nào. [2]
Phép thử cho điểm thị hiếu đƣợc đánh giá theo thang điểm 5, điểm 1 ứng với trạng thái “rất ghét”, còn từ 2 đến 5 ứng với mức độ ƣa thích dần, ở điểm 5 ứng với trạng thái” rất thích”.
2.2.4.2 Khảo sát chỉ tiêu vi sinh.
a. Mục đích: Chỉ tiêu vi sinh là một trong những chỉ tiêu quan trọng của sản phẩm trƣớc khi đƣa ra thị trƣờng, mục tiêu của thí nghiệm này là để đảm bảo vấn đề an toàn thực phẩm theo TCVN. Ngoài ra, đây là một sản phẩm probiotic nên ngoài các chỉ tiêu để đảm bảo an toàn thực phẩm, sản phẩm còn phải đạt chỉ tiêu về vi khuẩn lactic.
b. Phƣơng pháp: Khảo sát hoạt tính probiotic theo thời gian bảo quản. Sản phẩm đƣợc tạo ra trong điều kiện lên men tối ƣu sẽ đƣợc bảo quản ở 4– 6oC và bắt đầu theo dõi kiểm tra một số chỉ tiêu tại thời điểm tạo sản phẩm và các tuần lễ tiếp sau đó. Chỉ tiêu theo dõi quan trọng nhất là số lƣợng vi khuẩn lactic, ngoài ra kiểm tra thêm các chỉ tiêu khác nhƣ pH và cấu trúc sản phẩm…
2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.3.1 Phƣơng pháp hóa lý
2.3.1.1 Phương pháp xác định pH.
Dùng pH kế của phòng Thí Nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Bách Khoa.
40
2.3.1.2 Phương pháp xác định nồng độ chất khô (o Brix)
Nhằm xác định tổng lƣợng chất hòa tan tƣơng đƣơng số gram succrose/100g dung dịch (%) bằng khúc xạ kế có thang đó 0-32oBx
2.3.1.3 Hàm lượng acid lactic (%)
Hàm lƣợng acid tổng qui về acid lactic. Coi nhƣ acid lactic là chủ yếu trong dung dịch lên men. Dùng một dung dịch kiềm chuẩn (NaOH hay KOH) 0,1N để trung hòa acid lactic có trong mẫu với phenolphtalein 1% làm chất chỉ thị.
2.3.2 Phƣơng pháp vi sinh.
Phương pháp đếm khuẩn lạc.
Định lƣợng gián tiếp số lƣợng tế bào vi khuẩn lactic bằng phƣơng pháp đếm số lƣợng khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng thạch đĩa MRS.
2.3.3 Phƣơng pháp đánh giá cảm quan.
Nguyên tắc: Phép thử đƣợc lựa chọn là phép thử cho điểm thị hiếu để đánh giá trên các chỉ tiêu màu sắc, mùi vị, mức độ ƣa thích chung và phép thử cho điểm chất lƣợng tổng hợp của sản phẩm. Ngƣời thử là sinh viên đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên và không qua huấn luyện. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp: Sản phẩm đƣợc khảo sát trên 15 ngƣời. Ngƣời thử sẽ nếm và cho điểm về màu sắc, cấu trúc, mùi, vị. Sau đó ngƣời thử sẽ cho điểm độ ƣa thích chung đối với sản phẩm [11].
41
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 MỘT SỐ KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM – TÁC NHÂN VI SINH VẬT SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI. BIFIDUM – TÁC NHÂN VI SINH VẬT SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI.
Giống Bifidobacterium bifidum (P10) thuần chủng do bộ môn Công nghệ sinh học cung cấp.
3.1.1 Quan sát vi thể - đại thể.
Khuẩn lạc của Bifidobacterium bifidum có hình tròn, bờ đều, mép trơn, bóng láng, bề mặt ít lồi, màu trắng đục, phát triển tốt trên môi trƣờng MRS thạch đĩa sau 48 giờ ủ ở 37oC , đƣờng kính khoảng 0,8 – 1mm.
Hình 3.1 Hình khuẩn lạc Bifidobacterium bifidum
Các tế bào vi khuẩn Bifidobacteria bắt màu hống tím, tế bào dạng hình que, đặc biệt có hình dạng chữ “Y” và chữ “V” rất rõ.
42
3.1.2 Tăng sinh giống trên môi trƣờng MRS.
Giống đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng MRS lỏng sau 24 giờ nuôi và đƣợc xác định gián tiếp số lƣợng tế bào bằng cách đếm số lƣợng các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng thạch đĩa.
Mật độ giống ổn định trong khoảng 3,88 x 109 cfu/ml sau 24 giờ nuôi cấy, cho