a. Mục đích: Chỉ tiêu vi sinh là một trong những chỉ tiêu quan trọng của sản phẩm trƣớc khi đƣa ra thị trƣờng, mục tiêu của thí nghiệm này là để đảm bảo vấn đề an toàn thực phẩm theo TCVN. Ngoài ra, đây là một sản phẩm probiotic nên ngoài các chỉ tiêu để đảm bảo an toàn thực phẩm, sản phẩm còn phải đạt chỉ tiêu về vi khuẩn lactic.
b. Phƣơng pháp: Khảo sát hoạt tính probiotic theo thời gian bảo quản. Sản phẩm đƣợc tạo ra trong điều kiện lên men tối ƣu sẽ đƣợc bảo quản ở 4– 6oC và bắt đầu theo dõi kiểm tra một số chỉ tiêu tại thời điểm tạo sản phẩm và các tuần lễ tiếp sau đó. Chỉ tiêu theo dõi quan trọng nhất là số lƣợng vi khuẩn lactic, ngoài ra kiểm tra thêm các chỉ tiêu khác nhƣ pH và cấu trúc sản phẩm…
2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.3.1 Phƣơng pháp hóa lý
2.3.1.1 Phương pháp xác định pH.
Dùng pH kế của phòng Thí Nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Bách Khoa.
40
2.3.1.2 Phương pháp xác định nồng độ chất khô (o Brix)
Nhằm xác định tổng lƣợng chất hòa tan tƣơng đƣơng số gram succrose/100g dung dịch (%) bằng khúc xạ kế có thang đó 0-32oBx
2.3.1.3 Hàm lượng acid lactic (%)
Hàm lƣợng acid tổng qui về acid lactic. Coi nhƣ acid lactic là chủ yếu trong dung dịch lên men. Dùng một dung dịch kiềm chuẩn (NaOH hay KOH) 0,1N để trung hòa acid lactic có trong mẫu với phenolphtalein 1% làm chất chỉ thị.
2.3.2 Phƣơng pháp vi sinh.
Phương pháp đếm khuẩn lạc.
Định lƣợng gián tiếp số lƣợng tế bào vi khuẩn lactic bằng phƣơng pháp đếm số lƣợng khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng thạch đĩa MRS.
2.3.3 Phƣơng pháp đánh giá cảm quan.
Nguyên tắc: Phép thử đƣợc lựa chọn là phép thử cho điểm thị hiếu để đánh giá trên các chỉ tiêu màu sắc, mùi vị, mức độ ƣa thích chung và phép thử cho điểm chất lƣợng tổng hợp của sản phẩm. Ngƣời thử là sinh viên đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên và không qua huấn luyện.
Phương pháp: Sản phẩm đƣợc khảo sát trên 15 ngƣời. Ngƣời thử sẽ nếm và cho điểm về màu sắc, cấu trúc, mùi, vị. Sau đó ngƣời thử sẽ cho điểm độ ƣa thích chung đối với sản phẩm [11].
41
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 MỘT SỐ KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM – TÁC NHÂN VI SINH VẬT SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI. BIFIDUM – TÁC NHÂN VI SINH VẬT SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI.
Giống Bifidobacterium bifidum (P10) thuần chủng do bộ môn Công nghệ sinh học cung cấp.
3.1.1 Quan sát vi thể - đại thể.
Khuẩn lạc của Bifidobacterium bifidum có hình tròn, bờ đều, mép trơn, bóng láng, bề mặt ít lồi, màu trắng đục, phát triển tốt trên môi trƣờng MRS thạch đĩa sau 48 giờ ủ ở 37oC , đƣờng kính khoảng 0,8 – 1mm.
Hình 3.1 Hình khuẩn lạc Bifidobacterium bifidum
Các tế bào vi khuẩn Bifidobacteria bắt màu hống tím, tế bào dạng hình que, đặc biệt có hình dạng chữ “Y” và chữ “V” rất rõ.
42
3.1.2 Tăng sinh giống trên môi trƣờng MRS.
Giống đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng MRS lỏng sau 24 giờ nuôi và đƣợc xác định gián tiếp số lƣợng tế bào bằng cách đếm số lƣợng các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng thạch đĩa.
Mật độ giống ổn định trong khoảng 3,88 x 109 cfu/ml sau 24 giờ nuôi cấy, cho phép đƣa vào quá trình lên men tạo sản phẩm.
Mật độ giống đƣợc theo dõi ổn định trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
3.1.3 Chuyển giống vào môi trƣờng trung gian sữa gầy.
Môi trƣờng sữa gầy 3% đƣợc tiệt trùng ở 105o
C trong 30 phút.
Tế bào vi khuẩn phát triển trong môi trƣờng sữa gầy đƣợc chuyển qua môi trƣờng sữa gầy. Ủ canh trƣờng ở 37o
C trong 26 giờ.
Khảo sát quá trình tăng trƣởng của giống trên môi trƣờng sữa gầy trong 26 giờ. Kết quả bƣớc đầu ghi nhận nhƣ sau:
Đồ thị 3.1 Đƣờng cong sinh trƣởng của Bifidobacterium bifidum trong môi trƣờng sữa gầy (3%)
Pha tiềm tàng (pha lag) kéo dài khoảng 6 giờ, đó là thời gian vi khuẩn thích nghi với môi trƣờng sữa gầy. Pha tăng trƣởng (pha log) diễn ra mạnh trong 10 giờ kế tiếp và sinh khối vi khuẩn đạt cực đại là 4 x 108 cfu/ml vào 20 giờ kể từ khi nuôi cấy. Pha
6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 lo g (C FU /m l)
43
ổn định kéo dài khoảng 6 giờ và bắt đầu giảm dần từ giờ thứ 22, giảm đến 2,8 x108 cfu/ml sau 26 giờ nuôi cấy. pH giảm từ 6.2 xuống còn 3.9
Khảo sát này cho thấy khoảng thời gian tốt nhất để thu nhận sinh khối vi khuẩn là khoảng 20 giờ kể từ giờ nuôi cấy.
3.1.4 Xử lý nguyên liệu trái cà chua.
Trái cà chua trƣớc khi chà qua lƣới để nhận pure cần đƣợc chần ở nhiệt độ cao. Chần có 3 tác dụng:
Khử hoạt tính enzyme có trong thịt trái, để tránh các phản ứng hóa học bởi sự xúc tác của enzyme làm giảm chất lƣợng sản phẩm ví dụ oxy hóa các polyphenol do xúc tác của polyphenol oxydase làm tối màu sản phẩm
Làm mềm cấu trúc của nguyên liệu để quá trình chà đƣợc dễ dàng hơn. Khi chần, protopectin chuyển thành pectin hòa tan làm cho việc bóc vỏ, bỏ
hạt đƣợc nhanh và phế liệu ít.
Bảng 3.1. Tƣơng quan thời gian chần, nhiệt độ chần và hiệu suất chần cà chua. Thời gian (phút) Nhiệt độ ( o C) Khối lƣợng cà chua (g) Khối lƣợng pure (g) Hiệu suất (%) 1 70 200 137,5 68,7 80 211 150 72 90 200 145 78 2 70 200 144 71 80 200 146 73 90 220 176 80 3 70 206 161 72,5 80 200 158 80 90 217 217 80,6
Trong quá trình chần sẽ xảy ra hiện tƣợng nƣớc chần thấm vào trái cà chua và ngƣợc lại, một phần chất khô trong trái cà chua khuếch tán ra ngoài. Thời gian chần càng lâu thì tổn thất càng lớn
44
Hiệu suất pure thu đƣợc cao nhất (80,6%) khi xử lí chần ở 90oC trong vòng 3 phút, chần với thời gian 2 phút hiệu suất đạt đƣợc là 80%. Với thời gian chần càng lâu thì dễ dẫn đến hiện tƣợng cà chua sẽ có mùi nấu chín, vì vậy để tạo tiền đề cho sản mùi vị sản phẩm đạt chất lƣợng tốt, chọn tiến hành chần cà chua ở 90oC trong vòng 2 phút.
Hình 3.3 Pure cà chua thu đƣợc sau khi chà.
3.2 KHẢO SÁT QUI TRÌNH LÊN MEN VÀ TẠO SẢN PHẨM. 3.2.1 Khảo sát hàm lượng đường bổ sung. 3.2.1 Khảo sát hàm lượng đường bổ sung.
Đƣờng vừa đóng vai trò là cơ chất thêm vào cho vi khuẩn hoạt động tạo acid lactic, vừa tạo vị ngọt cho sản phẩm sau khi lên men.
Nếu nồng độ đƣờng sucrose trong dịch lên men càng cao, lƣợng acid lactic sinh ra càng lớn. Tuy nhiên, nếu nồng độ đƣờng trong dịch lên men quá cao sẽ tạo áp suất thẩm thấu lớn, phá vỡ cân bằng sinh lý của vi khuẩn lactic, làm cho vi khuẩn bị ức chế, giảm khả năng sinh trƣởng và phát triển. Ngƣợc lại, nếu nồng độ đƣờng quá ít, hàm lƣợng acid lactic tạo thành ít, lƣợng đƣờng sót còn lại trong dịch lên men ít, ảnh hƣởng đến chất lƣợng cảm quan sản phẩm. Vì vậy, trong lên men, cần khảo sát nồng độ đƣờng ban đầu thích hợp để tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic hoạt động tối ƣu, đồng thời đạt chất lƣợng cảm quan sản phẩm tốt nhất.
45
Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng hàm lƣợng đƣờng bổ sung ban đầu đến quá trình lên men lactic, tiến hành thí nghiệm với hàm lƣợng đƣờng ban đầu thay đổi, đồng thời cố định pH của dịch lên men ở pH 5, tỉ lệ cấy giống 5%, lên men ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ.
Bảng 3.2 Khảo sát hàm lƣợng đƣờng bổ sung vào dịch cà chua lên men. Lƣợng đƣờng bổ sung (g/100ml) Brix trƣớc lên men Brix sau lên men pH Hàm lƣợng acid lactic (%) Mùi vị sản phẩm 5 11.2 9 3.62 4.5 Vị chua nhiều 7 13.6 10 3.62 4.5 Vị chua nhiều 10 16 12.6 3.59 6.75 Chua 13 17.4 14.4 3.59 6.75 Chua 15 18.8 16 3.56 7.2 Chua và ngọt vừa 17 20 16.6 3.56 7.2 Ngọt có vị chua 20 24 19.4 3.6 6.75 Ngọt đậm. 25 26 22.6 3.6 6.3 Ngọt có mùi đƣờng
Từ kết quả bảng cho thấy, khi nồng độ chất khô ban đầu ( độ Brix) tăng từ 11.2 đến 26 thì nồng độ chất khô sau lên men cũng tăng tƣơng ứng từ 9 đến 22.6. Hàm lƣợng đƣờng sót trong các mẫu tăng dần theo nồng độ chất khô ban đầu, hàm lƣợng này càng lớn sẽ tạo ra vị ngọt khác nhau, ảnh hƣởng đến hậu vị và chất lƣợng cảm quan sản phẩm.
46
Đồ thị 3.2 Tƣơng quan giữa hàm lƣợng đƣờng bổ sung và acid lactic.
Khi lƣợng đƣờng bổ sung thay đổi từ 5g đến 25g / 100ml dịch nƣớc ép cà chua, pH thay đổi trong khoảng 3.56 đến 3.62, độ Brix tăng dần từ 9 đến 22.6, hàm lƣợng acid lactic thay đổi trong khoảng từ 4.5 – 7.2% .
Từ kết quả đƣợc trình bày trong đồ thị 3.2 cho thấy, khi hàm lƣợng đƣờng bổ sung tăng, hàm lƣợng acid lactic sau lên men tăng, đạt cao nhất ở mẫu bổ sung 15 và 17 g đƣờng, tƣơng ứng với độ Brix 18.8 và 20. Tuy nhiên, độ Brix trong dịch lên men cao quá sẽ gây ức chế sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn. Khi tăng nồng độ chất khô lên 24 và 26oBx, lƣợng lactic giảm, do dịch lên men có nồng độ đƣờng cao, tạo áp suất thẩm thấu lớn, mất trạng thái cân bằng sinh lý của tế bào, ức chế hoạt động của vi khuẩn. Về mặt kinh tế, nếu lên men với nồng độ chất khô lớn, thì cần phải bổ sung lƣợng sucrose lớn vào dịch trƣớc lên men, điều này làm tăng chi phí sản xuất, dẫn đến tăng giá thành sản phẩm.
Dựa vào số liệu thu đƣợc cũng nhƣ đánh giá cảm quan sơ bộ, hàm lƣợng đƣờng thích hợp bổ sung vào dịch lên men đƣợc chọn là 17g/100ml dịch lên men, và là tiền đề cho các khảo sát tiếp theo.
3.2.2 Khảo sát tỉ lệ giống cấy.
Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm lên men, trong đó tỉ lệ giống cấy có những ảnh hƣởng nhất định. Mật độ vi khuẩn trong môi trƣờng tăng sinh giống cần đƣợc duy trì với mức độ ổn định và thuẩn khiết để giúp tăng độ chính xác khi đánh giá quá trình lên men thông qua các thông số lên men.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 Hàm lƣ ợng acid lactic (%) Hàm lƣợng đƣờng bổ sung (g/100ml) 25 5 7 10 13 15 17 20
47
Trong quá trình lên men, tỉ lệ giống cấy ban đầu ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm lên men.
Nếu lƣợng giống ban đầu quá ít thì thời gian để vi khuẩn tăng trƣởng và phát triển đạt mật độ cần thiết cho quá trình lên men kéo dài, sẽ dễ bị tạp nhiễm. Ngƣợc lại, nếu lƣợng giống cấy quá cao, sẽ rút ngắn thời gian lên men, hạn chế đƣợc tạp nhiễm, tuy nhiên, nếu thời gian lên men quá ngắn, hƣơng vị của sản phẩm lên men sẽ bị ảnh hƣởng do sản phẩm chƣa ổn định về tính acid, độ ngọt hay mùi hƣơng.
Vì vậy, việc xác định tỉ lệ giống cấy thích hợp không những sẽ rút ngắn thời gian lên men mà còn góp phần nâng cao chất lƣợng cảm quan của sản phẩm.
Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ men giống cho vào dịch lên men, nƣớc ép cà chua đƣợc lên men với hàm lƣợng đƣờng bổ sung 17g/100ml tƣơng ứng với nồng độ chất khô hòa tan là 20o Bx, pH 5, tỉ lệ giống cấy thay đổi 3%, 5%, 7%, 9%, và 11%, mật độ tế bào giống 3.88 x 108. Tiến hành khảo sát tỉ lệ giống cấy khi lên men. Kết quả thu nhận đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.3 Khảo sát tỉ lệ giống cấy. Tỉ lệ giống (ml giống/ 100ml dịch lên men) pH Hàm lƣợng acid lactic (%) Brix 3 3.62 5.4 16.8 5 3.60 5.85 16.8 7 3.59 6.75 16.2 9 3.59 6.75 16.2 11 3.54 7.2 15.8
Khi tăng tỉ lệ giống từ 3% đến 7 %, nồng độ chất khô sau lên men giảm từ 16.8 xuống 16.2, điều này có nghĩa là lƣợng đƣờng đƣợc vi khuẩn sử dụng tăng lên. Acid lactic tạo thành tăng lên từ 5.4 đến 6.75.
Sự ảnh hƣởng của tỉ lệ giống cấy đến quá trình lên men đƣợc thể hiện rõ hơn trong đồ thị 3.3.
48
Đồ thị 3.3 Tƣơng quan giữa tỉ lệ giống cấy và hàm lƣợng acid lactic, độ Brix. Thời gian lên men là một vấn đề quan trọng và phụ thuộc bởi nhiều yếu tố nhƣ pH, nhiệt độ…mà trên hết là số lƣợng và chất lƣợng giống vi sinh vật. Vì vậy cần tiến hành khảo sát hàm lƣợng acid lactic phụ thuộc vào thời gian lên men với cùng một tỉ lệ giống cấy trong 72h.
Bảng 3.4 Tƣơng quan tỉ lệ giống cấy, thời gian lên men và hàm lƣợng acid lactic. Tỉ lệ giống
(ml/100ml) 12 (giờ) 24 (giờ) 36 (giờ) 48 (giờ) 60 (giờ) 72 (giờ)
3 4.5 4.85 5.4 6.3 9.45 9.9 5 5.4 5.85 6.3 6.75 9.9 9.45 7 5.4 6.3 7.2 9.9 9.45 6.3 9 6.3 6.3 7.2 9.9 9.45 6.3. 11 6.3 7.2 9.9 9.45 8.1 7.2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Tỉ lệ giống cấy (%) acid lactic (%) Brix 3 5 7 9 11
49
Đồ thị 3.4 Tƣơng quan tỉ lệ giống, thời gian lên men và hàm lƣợng acid lactic. Ở giai đoạn đầu lên men, vi khuẩn thích nghi với môi trƣờng, lên men lactic không đáng kể, tốc độ lên men phụ thuộc lƣợng giống cho vào ban đầu. Đến lúc đi vào trạng thái cân bằng, vi khuẩn phát triển và lên men mạnh, hàm lƣợng acid lactic sinh ra nhiều. Khi alctic tăng, pH giảm ức chế lại vi khuẩn, hoạt lực lên men giảm dần.
Trong 72 giờ lên men, ta thấy:
Với tỉ lệ giống 3%, 5%, lƣợng giống ít, thời gian lên men kéo dài, hoạt lực lên men mạnh nhất lúc 72 giờ với 3% giống và 60 giờ với 5%.
Với tỉ lệ giống 11%, vi khuẩn lên men mạnh, hàm lƣợng chất khô sau lên men đạt thấp nhất, lƣợng acid lactic tạo ra nhiều, ức chế một phần hoạt động của vi khuẩn. Hoạt lực lên men mạnh nhất lúc 36 giờ.
Riêng với tỉ lệ cấy giống 7% và 9%, hoạt lực lên men lactic đạt cao nhất lúc 48 giờ. Nhƣ vậy, sử dụng tỉ lệ giống 7%, 9% thì thời gian lên men rút ngắn 12 giờ so với tỉ lệ giống là 3%, 5 %. Tuy không có sự khác biệt lớn về hàm lƣợng chất khô sau lên men, hàm lƣợng acid lactic, pH giữa tỉ lệ cấy giống 7% và 9%, nhƣng sản phẩm là định hƣớng probiotic nên lƣợng vi khuẩn probiotic tồn tại trong sản phẩm là yếu tố
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 24 36 48 60 72 Hàm lƣ ợng acid lactic (%)
Thời gian lên men ( giờ)
3% 5% 7% 9% 11%
50
quan trọng, vì vậy tỉ lệ giống 9% đƣợc chọn là tối ƣu nhất, và là tiền đề cho khảo sát tiếp theo.
Với tỉ lệ giống 9%, tiếp tục khảo sát số lƣợng tế bào vi khuẩn probiotic trong sản phẩm trong 72 giờ lên men. Kết quả thu nhận đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.5 Tƣơng quan thời gian lên men và số lƣợng vi khuẩn probiotic. Thời gian (giờ) 12 24 36 48 60 72 Số tế bào (cfu/ml) 1.23 x 10 9 4.03 x 109 1.30 x 1010 4.6 x 10 10 2.32x 1010 9.7 x 109
Dựa vào số liệu thu nhận đƣợc cùng với đánh giá cảm quan sơ bộ ban đầu, tỉ lệ giống cấy lên men 9% và thời gian lên men 48 giờ là tối ƣu nhất.
3.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ.
Nhiệt độ là yếu tố đóng vai trò quan trọng trong lên men, nhiệt độ thích hợp sẽ tạo điều kiện tối ƣu cho vi khuẩn phát triển, lên men đạt chất lƣợng sản phẩm tốt. Tiến hành lên men dịch cà chua với hàm lƣợng chất khô ban đầu là 20o Bx (tƣơng ứng với 17g đƣờng/100ml), cố định ở pH 5, lƣợng giống cấy 9%, lên men trong 48 giờ dƣới