Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có đƣờng kính 4 cm, cao 80 cm, lót đáy cột bằng một miếng bông thủy tinh có thể cho dung dịch rửa giải đi ra.
Tẩm mẫu: Hòa tan 15 gam cặn n- BuOH trong MeOH, sau đó tẩm silicagel (cỡ hạt 40-63 μm, Merck) bằng cách trộn đều vào nhau, khi MeOH bay hơi hết thu đƣợc bột mịn tơi màu vàng thẫm.
Nhồi cột: Tiến hành nhồi cột theo phƣơng pháp nhồi ƣớt. 100 gam silicagel đƣợc khuấy đều và ngâm trong dung môi điclometan cho trƣơng nở trong 15 phút. Sau đó, vừa khuấy vừa đổ nhanh hỗn hợp silicagen và dung môi điclometan lên
cột sắc kí, đồng thời mở khóa phía dƣới cho dung môi chảy ra. Trong quá trình nhồi cột có sử dụng quả bóp gõ nhẹ dọc theo cột loại bỏ các bọt khí và cho điclometan chảy qua nhiều lần để cột đƣợc nén đều.
Chạy sắc kí cột: Khi dung môi trong cột xuống đến cách bề mặt silicagen đã đƣợc nén đều khoảng 4cm thì đƣa mẫu đã tẩm lên cột. Sau đó đặt một miếng bông thấm lên bề mặt chất để tránh sự khuếch tán ngƣợc của chất tẩm. Tiến hành rửa giải bằng dung môi theo gradient, tăng dần độ phân cực: đầu tiên với 100 % điclometan, tiếp theo là hỗn hợp điclometan : MeOH theo tỉ lệ tăng dần MeOH, và cuối cùng dội cột với MeOH. Tốc độ rửa giải cỡ khoảng 5-6 ml/phút. Dung dịch rửa giải đƣợc thu vào các ống nghiệm đã đánh số thứ tự.
Khảo sát các phân đoạn rửa giải: Qua kiểm tra bằng SKLM, những ống nghiệm có sắc ký đồ giống nhau đƣợc gom lại, thu đƣợc 4 phân đoạn, kí hiệu là
GMB I-IV.
Tiến hành rửa chất cùng với kỹ thuật kết tinh lại, chúng tôi đã thu đƣợc chất tinh khiết ở phân đoạn GMB II, kí hiệu là D4.
Kết quả chạy sắc ký cột xem ở chƣơng 4: Kết quả và thảo luận
3.5.3 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất đã phân lập được từ phần chiết n-BuOH
Chất D4: Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt; hiện màu vàng nhạt với thuốc thử Vanilin/ H2SO4 đặc, t0, hiện màu nâu đen với FeCl3 ở ngay nhiệt độ phòng
Phổ 1H- NMR(500MHz, CDCl3, δ, ppm): 13.68(1H; s; OH-1); 6.83(1H; d; j= 3.6 Hz; H-4); 6.24(1H; s; H-5); 6.72(1H; d; J= 10 Hz; H-16); 5.56(1H; d; J= 10 Hz; H-17); 5.26(1H; m; J= 6 Hz, 3.6 Hz; H-12); 4.08(2H; d; J= 6 Hz; H-11); 3.80(3H; s; H-22); 1.83(3H; s; H-15); 1.69(3H; s; H-14); 1.46(6H; s; H-20, H-21). Phổ 13 C- NMR(500 MHz, CDCl3, ppm): 182(C-9); 159.91(C- 3); 157.96(C- 1); 156.31(C-4a); 155.77(C-10a); 154.56(C-6,7); 142.71(C-13); 137.04(C-8); 132.13(C-2); 127.13(C-17); 123.16(C-12); 115.74(C-16); 112.25(C-8a); 104.52(C-
9a); 77.94(C-18); 101.69(C-5); 94.16(C-4); 62.05(C-22); 28.33(C-20,21); 26.56(C-11); 25.79(C-15) và 18.21(C-14).
3.6. Thử hoạt tính sinh học.
3.6.1 Hoạt tính chống oxi hóa DPPH
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do đƣợc dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, đƣợc xác định bằng cách đo quang ở bƣớc sóng = 517 nm.
Cách tiến hành: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong Methanol (MeOH). Chất thử đƣợc pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt đƣợc một dãy các nồng độ 256; 64; 16; 4; 1 g/ml. Để thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chƣa phản ứng bằng máy đọc Genios Tecan ở bƣớc sóng 517 nm. % quét gốc tự do DPPH của mẫu thử đƣợc tính theo công thức sau:
SC% = (OD trắng – OD mẫu thử)/ ODtrắng (%).
EC50 đƣợc tính theo giá trị SC tƣơng quan với các nồng độ khác nhau của chất thử, thí nghiệm đƣợc lặp lại với n = 3.
Đƣờng chuẩn biểu thị mối tƣơng quan giữa nồng độ DPPH và mật độ quang học:
Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH y = 0.3225x + 0.0241 R2 = 0.9938 0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 1.4000 1.6000 1.8000 0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000 Nồng độ DPPH mM M ật đ ộ q u an g h ọ c (O D )
Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa DPPH đƣợc trình bày trong chƣơng 4: Kết quả và thảo luận.
3.6.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh
3.6.2.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đƣợc thực hiện dựa trên phƣơng pháp pha loãng đa nồng độ. Đây là phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (Minimum inhibitor concentration - nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (Inhibitor concentration 50% - nồng độ ức chế 50%), MBC (Minimum bactericidal concentration - nồng độ diệt khuẩn tối thiểu).
3.6.2.2. Các chủng vi sinh vật kiểm định
Bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở ngƣời do ATCC cung cấp:
- Bacillus subtilis (ATCC 6633): là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thƣờng không gây bệnh.
- Staphylococcus aureus (ATCC 13709): cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thƣơng, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng.
- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đƣờng ruột lên men có ích, thƣờng có mặt trong hệ tiêu hoá của ngƣời và động vật.
- Escherichia coli (ATCC 25922): vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đƣờng tiêu hoá nhƣ viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đƣờng tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột.
- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thƣơng hàn, nhiễm trùng đƣờng ruột ở ngƣời và động vật.
- Candida albicans (ATCC 10231): là nấm men, thƣờng gây bệnh tƣa lƣỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa.
3.6.2.3. Môi trường nuôi cấy
MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud-2% dextrose broth) và SA (Sabouraud-4% dextrose agar) cho nấm.
3.6.2.4. Cách tiến hành
- Pha loãng mẫu thử:
Mẫu ban đầu đƣợc pha loãng trong DMSO và nƣớc cất tiệt trùng thành một dãy 05 nồng độ theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết là 256g/ml và với chất sạch là 128g/ml.
Lấy 10l dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200l dung dịch vi khuẩn và nấm có nồng độ 5.105
CFU/ml, ủ ở 37oC/24h.
- Xử lý kết quả
+ Giá trị MIC đƣợc xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật.
+ Giá trị IC50 đƣợc tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trƣờng nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.
+ Giá trị MBC đƣợc xác định bằng đĩa thạch, trong đó có số khuẩn lạc tƣơng đƣơng với điều khiển (-).
- Chất tham khảo
+ Kháng sinh Ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram (+); chủng E.c và S.e
với giá trị IC50 trong khoảng 0,05-2g/ml.
+ Kháng sinh Pen/Step cho chủng Pa với giá trị IC50 trong khoảng 4-5g/ml. + Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5-1 g/ml.
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh đƣợc trình bày trong chƣơng 4: kết quả và thảo luận
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Điều chế các phần chiết
Các chất trong măng cụt đƣơc chiết theo nguyên tắc tăng dần độ phân cực. Đầu tiên, vỏ măng cụt đƣợc ngâm chiết với etanol. Tiếp theo, dịch chiết etanol và nƣớc đƣợc phân bố lần lƣợt với điclometan và n- Butanol.
Qui trình chiết các lớp chất trong vỏ quả măng cụt đƣợc tóm tắt trong sơ đồ 4.1.
Hiệu suất điều chế các phần chiết điclometan và n- Butanol từ vỏ măng cụt đƣợc nêu ra trong bảng 4.1
Bảng 4.1 Hiệu suất các phần chiết từ vỏ quả măng cụt
STT Cặn chiết Kí hiệu Khối lượng
(g)
Hiệu suất %*
1 Điclometan GMD 121,3 6.06 2 n- Butanol GMB 22,23 1.11
(*) Tính theo khối lƣợng mẫu khô ban đầu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả trên cho thấy cặn điclometan có khối lƣợng lớn với hiệu suất hơn hẳn so với cặn n- Butanol. Đây cũng là một điều cần lƣu ý khi nghiên cứu, nhất là nghiên cứu với lƣợng lớn
Sơ đồ 4.1. Quy trình chiết các lớp chất trong vỏ quả măng cụt xanh
Vỏ quả măng cụt đã nghiền nhỏ (2,0 kg bột khô)
- Ngâm chiết với etanol 96% trong 4 lần ( 3 ngày/ lần)
- Lọc dịch chiết qua giấy lọc
Dịch chiết etanol
- Cất loại dung môi dƣới áp suấtgiarm đến còn 0,3 L (t< 500C) - Pha loãng bằng 0,5 L nƣớc cất Dịch chiết etanol- nƣớc Diclometan Dịch chiết điclometan
Dịch chiết còn lại sau khi chiết điclometan
n- BuOH
Dịch chiết n- BuOH
Dịch còn lại sau khi chiết 1- Làm khô bằng Na2SO4 khan 2- Loại điclometan bằng máy cất chân không, ở t <500C 1- Làm khô bằng Na2SO4 khan 2- Loại n- BuOH bằng máy cất chân không, ở t 800C
Cặn điclometan
(GMD)(6.06%)
Cặn n- BuOH ( GMB)(1.11%)
4.2. Phân tích và phân tách cặn chiết diclometan (GMD)
4.2.1.Phân tích cặn chiết điclometan (GMD) bằng TLC
Để có cơ sở cho việc phân tách các chất, cặn chiết điclometan đã đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng. Sử dụng hệ dung môi điclometan/axeton, (22:1, v/v) cho sự tách tốt nhất các vệt với giá trị Rf đƣợc trình bày trong bảng 4.2.
Bảng 4.2 Kết quả phân tích cặn chiết điclometan bằng TLC
Dấu “*” chỉ thứ tự vệt từ trên xuống
Dấu “+” chỉ sự đánh giá ƣớc chừng về lƣợng chất hiện trên bản mỏng. Dấu “-” chỉ sự không xuất hiện màu.
Dựa vào bản mỏng thu đƣợc, cùng với các tài liệu nghiên cứu trƣớc đấy, dự đoán vệt 1 và vệt 4 có khả năng là các xanthon có trong măng cụt ( vệt 4 có hàm lƣợng nhiều hơn so với vệt 1), và các vệt cách nhau khá xa.
TT* Rf Ánh sáng Tử ngoại Vanilin/H2SO4 đặc Vanilin/H2SO4 đặc/t0 1 0.886 Vàng nhạt (++) Nâu đỏ Vàng (++) Vàng hơn (++) 2 0.73 - Phát quang - - 3 0.61 - Phát quang - - 4 0.48 Vàng (+++) Nâu đỏ Vàng đậm (++++) Vàng hơn (++++) 5 0.18 - Nâu đỏ Vàng nâu (+) Vàng nâu (+)
4.2.2 Phân tách cặn chiết điclometan (GMD) bằng CC
15 gam cặn điclometan (GMD) đƣợc phân tách trên cột silicagel (Merck, cỡ hạt 40-63 μm).
Tiến hành rửa giải lần lƣợt với điclometan, hỗn hợp n-hexan/axeton với độ phân cực tăng dần. Quá trình rửa giải và dội cột đƣợc trình bày theo bảng 4.3.
Bảng 4.3 Quá trình phân tách cặn chiết điclometan (GMD) bằng CC
STT Ống nghiệm n- Hexan/aceton ( v/v) 1 1 - 9 100,0 : 0,0 2 10 – 19 98,0 : 2,0 3 20 – 40 95,0 : 5,0 4 41 – 50 93,0 : 7,0 5 51 – 80 90,0 : 10,0 6 81 – 90 85,0 : 15,0 7 91 – 100 80,0 : 20,0 8 101– 115 70,0 : 30,0 9 116 – 130 50,0 : 50,0 10 Dội cột 0,0 : 100,0
Các dung dịch rửa giải đƣợc thu vào các ống nghiệm, qua kiểm tra TLC, những ống nghiệm có sắc kí đồ giống nhau đƣợc gom lại thành 7 phân đoạn chính ( I → VII).
Phân đoạn I và III đƣợc xử lý tiếp (sắc kí cột, rửa chất, kết tinh lại) cho 3 chất tinh khiết, kí hiệu là D1, D2 và D3.
Sơ đồ 4.2 Quá trình phân tách cặn GMD (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.3. Phân tích và phân tách cặn chiết n- BuOH
4.3.1 Phân tích cặn n- BuOH bằng TLC
Để có cơ sở cho việc phân tách các chất, cặn chiết n- BuOH đã đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng. Sử dụng hệ dung môi điclometan/MeOH, (9:1, v/v) cho sự tách tốt nhất các vệt với giá trị Rf đƣợc trình bày trong bảng 4.4.
- CC, hệ dung môi n- hexan/acetone
- Kết tinh lại trong Hex- acetone.
- Rửa với n-hexan và hỗn hợp n- hexan/điclometan - Kết tinh trong các hệ khác nhau (điclometan, n- hexan/axeton,vv...) - CC, silicagel (Merck, 40-63 μm) - Rửa giải gradient dung môi: điclometan/axeton (II) 21-35 (III) 36-60 (IV) 61-80 (V) 81-90 (VI) 91-100 Các phân đoạn (VII) 101- 130 (I) 1-20 D1 D2, D3 Cặn GMD (15 gam)
Bảng 4.4 Kết quả phân tích cặn chiết n- BuOH bằng TLC
4.3.2 Phân tích cặn n- BuOH bằng CC
15 gam cặn điclometan (GMD) đƣợc phân tách trên cột silicagel (Merck, cỡ hạt 40-63 μm).
Tiến hành rửa giải lần lƣợt với điclometan, hỗn hợp n-hexan/axeton với độ phân cực tăng dần. Quá trình rửa giải và dội cột đƣợc trình bày theo bảng 4.5.
Bảng 4.5 Quá trình phân tách cặn chiết điclometan (GMB) bằng CC
STT Ống nghiệm Diclometan/metanol ( v/v) 1 1 - 9 100,0 : 0,0 2 10 – 19 98,0 : 2,0 3 20 – 40 95,0 : 5,0 4 41 – 50 93,0 : 7,0 5 51 – 80 90,0 : 10,0 6 81 – 90 85,0 : 15,0 7 91 – 100 80,0 : 20,0 8 Dội cột 0,0 : 100,0 TT* Rf Ánh sáng Vanilin/H2SO4 đặc Vanilin/H2SO4 đặc/t0 FeCl3 1 0.81 Vàng Vàng Vàng hơn Tím đen 2 0.70 Đỏ vàng Vàng Vàng Đen 3 0.59 - - - - 4 0.42 Vàng - - -
Qua kiểm tra TLC, gom các phân đoạn giống nhau ta đƣợc 4 phân đoạn GMB I-IV.
Chạy sắc ký cột CC phân đoạn GMBII hệ dung môi diclometan/Metanol, kết hợp với kết tinh lại ta thu đƣợc chất D4
Sơ đồ 4.3 Quá trình phân tách cặn GMB
4.4. Hằng số vật lý của các chất đã phân lập được từ các phần chiết
4.4.1. Chất D1
Tinh thể hình que, màu vàng tƣơi; nhiệt độ nóng chảy là 167 - 169 0C (kết tinh lại trong hệ dung môi n-hexan/axeton); Rf = 0,78 (TLC, silicagel,
- CC, hệ dung môi diclometan/Metanol
- Kết tinh lại trong MeOH/H2O
- CC, silicagel (Merck, 40-63 μm) - Rửa giải gradient dung môi: điclometan/axeton (II) 21-50 (III) 51-80 (IV) 81- 99 (I) 1-20 D4 Cặn GMD (15 gam)
điclometan/axeton (20:1), v/v); dƣới ánh sáng thƣờng có màu vàng nhạt, phun với vanilin/H2SO4 đặc + t0 cho màu vàng tƣơi.
4.4.2 Chất D2
Tinh thể hình kim màu vàng, Đnc. 1660
- 1680C(kết tinh trong n-hexan- axeton); Rf 0,66 (hệ dung môi: n-hexan- etyl axetat, 7:3, v/v); phát quang màu tím dƣới ánh sáng tử ngoại; cho màu vàng đậm hơn với thuốc thử vanilin/H2SO4+ T0, cho màu tím đen với thuốc thử FeCl3.
4.4.3.Chất D3
Tinh thể hình kim, màu vàng óng, nhiệt độ nóng chảy là 180-1810C (kết tinh lại trong hệ dung môi metanol/nƣớc); Rf = 0,67 (TLC, silicagel, n-hexan/etyl axetat (1:1), v/v); hiện màu vàng với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc, cho màu tím đen với thuốc thử FeCl3.
4.4.4 Chất D4
Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt; hiện màu vàng nhạt với thuốc thử Vanilin/ H2SO4 đặc, t0, hiện màu nâu đen với FeCl3 ở ngay nhiệt độ phòng.
4.5. Xác định cấu trúc các chất phân lập (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.5.1. Chất D1
Việc xác định cấu trúc đƣợc thực hiện dựa trên sự phân tích các dữ liệu phổ NMR.
Trên phổ cộng hƣởng từ proton (1
H-NMR, axeton-d6) của D1, hai tín hiệu singlet ở 12,33 và 11,30 cho thấy sự có mặt của hai nhóm hidroxyl chelat thế ở vị tri C-1 và C-8 của vòng xanthon[19]. Các tín hiệu đặc trƣng cho nhóm hai propenyl với 4 nhóm metyl ở C-20 ( 1,85; s); ở C-14 ( 1,80; s); ở C-19 ( 1,67; s); ở C-15 ( 1,66; s); 2 metylen proton của C-16 ( 3,66; d, J= 7,0 Hz) và 2 metylen proton của C-11 ( 3,45; d, J= 6,9 Hz); cũng nhƣ 2 metin proton của C-12 và C-17 xuất hiện ở 5,28 và 5,24; (m, 2H). Hai proton aromat nằm kề nhau cho hai doublet ở 7,31 (J= 8,8 Hz, H-6) và ở 6,62 (J= 8,8 Hz, H-7).
Các thông tin phân tích ở trên hoàn toàn đồng nhất với các dữ liệu phổ
1
H-NMR của Gartanin đƣợc nêu ra trong tài liệu [1, 3, 5]; chúng cũng phù hợp với các dữ liệu phổ 1H NMR đã công bố của 3-O-metylgartanin (= 8- hidroxycudraxanthon G). Nhƣ vậy, chất D1 đƣợc nhận dạng là gartanin, một chất đã phân lập từ cây măng cụt [1, 3, 5].
Gartanin (1,3,5,8-tetrahydroxy-2,4-diprenylxanthone)
4.5.2. Chất D2
Việc xác định cấu trúc đƣợc thực hiện dựa trên sự phân tích các dữ liệu phổ NMR
Phổ 1
H NMR (axeton-d6) của chất D1 và chất D2 về cơ bản tƣơng tự nhau, ngoại trừ có một số khác biệt ở vùng proton thơm (aromatic). Chất D2 có thêm proton, H-8 ( 7,70; d,d; J= 1,5 & 8,0 Hz). Do sự có mặt của H-8 nên tín hiệu
proton H-7 ở trở thành dạng triplet (ở chất D1, tín hiệu này là doublet) ở 7,25 (t;
J= 8,0 Hz), còn proton H-6 xuất hiện ở dạng doulet-doublet có tâm ở 7,37 (d,d; 1,5 & 8,0). Phổ DEPT cũng cho những thông tin phù hợp với phổ 1H NMR, nhƣ số nguyên tử cacbon bậc 3 tăng thêm 1 (thành 5C), kèm theo giảm đi 1C bậc 4 (còn