Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để tách và làm sạch chất rắn. Việc làm sạch chất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của hợp chất mục tiêu và của tạp chất trong dung môi hoặc một hệ dung môi đã chọn.
2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc (các phương pháp phổ)
Các phƣơng pháp phổ hiện nay là các phƣơng pháp hiện đại và hữu hiệu nhất để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ bao gồm:
- Phổ khối lƣợng va chạm điện tử (EI-MS); - Phổ khối lƣợng phun bụi điện tử (ESI-MS);
- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chƣơng trình DEPT;
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM
3.1 Thiết bị và hóa chất.
Sắc ký lớp mỏng (TLC) đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck (Darmstadt, CHLB Đức) DC-Alufolien 60 F254 có chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm.
Sắc ký cột thƣờng (CC), sắc ký cô ̣t nhanh (FC) và sắc ký cột tinh chế (Mini- C) đƣợc thực hiện trên silica gel Merck (Darm-Stadt, CHLB Đƣ́ c) cỡ ha ̣t 63-200 μm, 63-100 μm và 40-63 μm.
Phổ khối lƣợng va chạm điện tử (EI-MS) đƣợc ghi trên thiết bị LC-MS- Orbitrap-XL (Thermo Scientific).
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chƣơng trình DEPT và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR) HMBC đƣợc ghi trên thiết bị Bruker AV 500 spectrometer. Độ chuyển dịch hóa học (δ) đƣợc biểu diễn theo ppm. Tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội zero
3.2 Nguyên liệu thực vật
Mẫu nghiên cứu là vỏ quả măng cụt có nguồn gốc từ miền Nam, đƣợc thu gom vào tháng 7 năm 2010. Sau khi bỏ cuống, tách bỏ phần thịt quả, vỏ quả măng cụt đƣợc rửa sạch, đem phơi khô ở nhiệt độ thƣờng, trong bóng râm. Sau đó, mẫu khô đƣợc đem nghiền thành dạng bột nhỏ, thu đƣợc 2,0 kg bột.
3.3 Điều chế các phần chiết từ vỏ quả măng cụt xanh
Phần tổng quan về thành phần hóa học của cây măng cụt nói chung cho thấy trong vỏ quả măng cụt chủ yếu có chứa các xanthon, là các hợp chất đều có độ phân cực khá, do đó việc chiết chủ yếu đƣợc thực hiện ở các dung môi có độ phân cực trung bình trở lên nhƣ điclometan,n-butanol, etyl axetat, axeton.
2,0 kg vỏ quả măng cụt đƣợc ngâm trong etanol 96 % ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau đó, lọc lấy dịch chiết, bã nguyên liệu lại đƣợc ngâm tiếp với etanol. Quá trình này đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ vậy 4 lần. Dịch chiết sau 4 lần đƣợc gom lại, đem cất loại dung môi dƣới áp suất thấp ở nhiệt độ khoảng 40 – 500C đến khi thu đƣợc khối sệt.
Pha khối sệt ở trên với nƣớc cất theo tỉ lệ 1:1 ( khoảng 0,3 l nƣớc cất), nhằm giải phóng các chất kém phân cực ra khỏi dịch chiết rồi chiết chúng bằng các dung môi theo độ phân cực tăng dần, trƣớc hết là điclometan , sau đó đến n- butanol.
Dịch chiết điclometan và n- butanol tiếp theo đƣợc xử lí nhƣ sau: làm khô với Na2SO4, sau đó đều đem cất loại dung môi dƣới áp suất giảm ở nhiệt độ 40-55
0C, thu đƣợc các cặc chiết ở dạng sệt, kí hiệu lần lƣợt là GMD và GMB.
Sơ đồ chiết và hiệu suất các phần chiết đƣợc trình bày ở chƣơng 4: Kết quả và thảo luận.
3.4 Phân tích cặn GMD
3.4.1 Phân tích cặn GMD bằng TLC
Hòa tan một lƣợng nhỏ cặn diclometan trong etyl axetat. Sau đó, dùng capilla để hút chất, chấm lên bản mỏng (DC-Alufolien 60 F254 dày 0,2 mm) sao cho vết chất cách mép dƣới của bản 1,0 cm và cách đều 2 mép bên là 0,5 cm. Sau khi sử dụng qua nhiều hệ dung môi và các tỉ lệ khác nhau (điclometan/n-hexan (9:1; 7:1; 5:1, v/v); etyl axetat/n-hexan; điclometan/etyl axetat; chlorofom/n- hexan;...), nhận thấy hệ dung môi điclometan : axeton (22:1, v/v) và n- hexan/ acetone cho sự tách tốt nhất đối với cặn điclometan.
Phát hiện các vết chất dƣới ánh sáng thƣờng , sau đó soi bản mỏng dƣới đèn tử ngoại UV (λ = 254 nm), cuối cùng phun bản mỏng với dung dịch vanilin/H2SO4, FeCl3 và hơ bản mỏng trên bếp điện để nhận biết vệt chất.
Kết quả khảo sát bản mỏng cặn chiết chiết GMD xem ở chƣơng 4: Kết quả và thảo luận.
3.4.2 Phân tách cặn GMD bằng CC
Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có đƣờng kính 4 cm, cao 80 cm, lót đáy cột bằng một miếng bông thủy tinh có thể cho dung dịch rửa giải đi ra.
Tẩm mẫu: Hòa tan 15 gam cặn điclometan trong etyl axetat, sau đó tẩm với 11.5 gam silicagel (cỡ hạt 40- 63 μm, Merck) bằng cách trộn đều vào nhau, khi etyl axetat bay hơi hết thu đƣợc bột mịn tơi màu vàng thẫm.
Nhồi cột: Tiến hành nhồi cột theo phƣơng pháp nhồi ƣớt. Silicagel đƣợc khuấy đều và ngâm trong dung môi n- Hexan cho trƣơng nở trong. Sau đó, vừa khuấy vừa đổ nhanh hỗn hợp silicagen và dung môi n- Hexan lên cột sắc kí, đồng thời mở khóa phía dƣới cho dung môi chảy ra. Trong quá trình nhồi cột có sử dụng quả bóp gõ nhẹ dọc theo cột loại bỏ các bọt khí và cho n- Hexan chảy qua nhiều lần để cột đƣợc nén đều.
Chạy sắc kí cột: Khi dung môi trong cột xuống đến cách bề mặt silicagen đã đƣợc nén đều khoảng 4cm thì đƣa mẫu đã tẩm lên cột. Sau đó đặt một miếng bông thấm lên bề mặt chất để tránh sự khuếch tán ngƣợc của chất tẩm. Tiến hành rửa giải bằng dung môi theo gradient, tăng dần độ phân cực: đầu tiên với 100 % n- Hexan, tiếp theo là hỗn hợp n- Hexan : axeton theo tỉ lệ tăng dần axeton, và cuối cùng dội cột với axeton. Tốc độ rửa giải cỡ khoảng 5-6 ml/phút. Dung dịch rửa giải đƣợc thu vào các ống nghiệm đã đánh số thứ tự.
Khảo sát các phân đoạn rửa giải: Qua kiểm tra bằng SKLM, những ống nghiệm có sắc ký đồ giống nhau đƣợc gom lại, thu đƣợc 7 phân đoạn, kí hiệu là
GMD I→ VII.
Tiến hành rửa chất cùng với kỹ thuật kết tinh lại, chúng tôi đã thu đƣợc chất tinh khiết ở phân đoạn GMD I, kí hiệu là D1.
Tiếp tục chạy sắc kí cột (với cột nhỏ hơn) phân đoạn GMD III với hệ dung môi n- hexan/acetone, và tiến hành rửa chất cùng với kỹ thuật kết tinh lại chúng tôi đã thu đƣợc 2 chất tinh khiết kí hiệu là D2 và D3.
Kết quả chạy sắc ký cột xem ở chƣơng 4: Kết quả và thảo luận.
3.4.3 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất đã phân lập được từ phần chiết điclometan ( GMD)
3.4.3.1 Chất D1
Tinh thể hình que, màu vàng tƣơi; nhiệt độ nóng chảy là 167-169 0C (kết tinh lại trong hệ dung môi n-hexan/axeton); Rf = 0,78 (TLC, silicagel, điclometan/axeton (20:1), v/v); dƣới ánh sáng thƣờng có màu vàng nhạt, phun với vanilin/H2SO4 đặc + t0 cho màu vàng tƣơi.
Phổ 1H-NMR (500 MHz, Me2CO-d6, , ppm): 12.33(1H; s; OH-1); 11.30(1H; s; OH-8); 7.31(1H; d; J= 8.8 Hz; H-6); 6.62(1H; d; J= 8,8 Hz; H-7); 5.28 và 5.24(2H; m; H-12 và H-17); 3.66(2H;d; J= 7,0 Hz; H-16); 3.45(2H; d; J= 7,0 Hz; H-11); 1.85(3H; s; H-20); 1.80(3H; s; H-14); 1.67(3H; s; H-19); 1.66(3H; s; H-15). 3.4.3.2 Chất D2
Tinh thể hình kim màu vàng, Đnc. 1660
- 1670C (kết tinh trong n-hexan- axeton); Rf 0,66 (hệ dung môi: n-hexan- etyl axetat, 7:3, v/v); phát quang màu tím dƣới ánh sáng tử ngoại; cho màu vàng đậm hơn với thuốc thử vanilin/H2SO4+ T0.
Phổ 1 H- NMR (500MHz, MeOD, δ, ppm): 12.32(1H; s; OH-1); 7.37(1H; d,d; J= 1.5Hz, 8.0 Hz; H-6); 7.25(1H; t; J= 8.0 Hz; H-8); 5.3(1H; m, H- 12);5.24(1H; m; H- 17); 3.79(2H; d; J= 7.0 Hz; H- 16); 3.57(2H; d;J= 7.0 Hz; H- 11); 1.79(3H; s; H- 15); 1.65(3H; s; H- 14); 1.86(3H; s; H- 20); 1.65(3H; s; H-19). 3.4.3.3. Chất D3
Tinh thể hình kim, màu vàng óng, nhiệt độ nóng chảy là 180-181 0
C (kết tinh lại trong hệ dung môi metanol/nƣớc); Rf = 0,67 (TLC, silicagel, n-hexan/etyl axetat (1:1), v/v); dƣới ánh sáng thƣờng có màu vàng, phun với vanili/H2SO4 đặc + t0 cho màu vàng đậm hơn.
Phổ 1 H-NMR (500 MHz, MeOD, , ppm): 6,74(1H; s; H-5); 6,28 (1H; s; H-4); 5,25(2H; m; H-12 và H-17); 4,12(1H; br. S; H-16); 4,11(1H; br. S; H-11); 3,78(3H; s; OCH3- 7); 1,85(3H; s; H-20); 1,80(3H; s; H-15); 1,70(3H;s; H-14); 1,68 (3H; s; H-19). Phổ MS, m/z, %: 411 (M+, 40), 352 (100), 219 (15), 149 (50), 114 (40). 3.5 Phân tích cặn GMB 3.5.1 Phân tích cặn GMB bằng TLC
Dùng capilla để hút chất, chấm lên bản mỏng (DC-Alufolien 60 F254 dày 0,2 mm) sao cho vết chất cách mép dƣới của bản 1,0 cm và cách đều 2 mép bên là 0,5 cm. Sau khi sử dụng qua nhiều hệ dung môi và các tỉ lệ khác nhau (điclometan/axetone (9:1; 7:1; 5:1, v/v); diclometan/etylaxetat; điclometan/Metanol...), nhận thấy hệ dung môi điclometan : MeOH (9:1, v/v) cho sự tách tốt nhất đối với cặn .
3.5.2 Phân tách cặn GMB bằng CC
Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có đƣờng kính 4 cm, cao 80 cm, lót đáy cột bằng một miếng bông thủy tinh có thể cho dung dịch rửa giải đi ra.
Tẩm mẫu: Hòa tan 15 gam cặn n- BuOH trong MeOH, sau đó tẩm silicagel (cỡ hạt 40-63 μm, Merck) bằng cách trộn đều vào nhau, khi MeOH bay hơi hết thu đƣợc bột mịn tơi màu vàng thẫm.
Nhồi cột: Tiến hành nhồi cột theo phƣơng pháp nhồi ƣớt. 100 gam silicagel đƣợc khuấy đều và ngâm trong dung môi điclometan cho trƣơng nở trong 15 phút. Sau đó, vừa khuấy vừa đổ nhanh hỗn hợp silicagen và dung môi điclometan lên
cột sắc kí, đồng thời mở khóa phía dƣới cho dung môi chảy ra. Trong quá trình nhồi cột có sử dụng quả bóp gõ nhẹ dọc theo cột loại bỏ các bọt khí và cho điclometan chảy qua nhiều lần để cột đƣợc nén đều.
Chạy sắc kí cột: Khi dung môi trong cột xuống đến cách bề mặt silicagen đã đƣợc nén đều khoảng 4cm thì đƣa mẫu đã tẩm lên cột. Sau đó đặt một miếng bông thấm lên bề mặt chất để tránh sự khuếch tán ngƣợc của chất tẩm. Tiến hành rửa giải bằng dung môi theo gradient, tăng dần độ phân cực: đầu tiên với 100 % điclometan, tiếp theo là hỗn hợp điclometan : MeOH theo tỉ lệ tăng dần MeOH, và cuối cùng dội cột với MeOH. Tốc độ rửa giải cỡ khoảng 5-6 ml/phút. Dung dịch rửa giải đƣợc thu vào các ống nghiệm đã đánh số thứ tự.
Khảo sát các phân đoạn rửa giải: Qua kiểm tra bằng SKLM, những ống nghiệm có sắc ký đồ giống nhau đƣợc gom lại, thu đƣợc 4 phân đoạn, kí hiệu là
GMB I-IV.
Tiến hành rửa chất cùng với kỹ thuật kết tinh lại, chúng tôi đã thu đƣợc chất tinh khiết ở phân đoạn GMB II, kí hiệu là D4.
Kết quả chạy sắc ký cột xem ở chƣơng 4: Kết quả và thảo luận
3.5.3 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất đã phân lập được từ phần chiết n-BuOH
Chất D4: Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt; hiện màu vàng nhạt với thuốc thử Vanilin/ H2SO4 đặc, t0, hiện màu nâu đen với FeCl3 ở ngay nhiệt độ phòng
Phổ 1H- NMR(500MHz, CDCl3, δ, ppm): 13.68(1H; s; OH-1); 6.83(1H; d; j= 3.6 Hz; H-4); 6.24(1H; s; H-5); 6.72(1H; d; J= 10 Hz; H-16); 5.56(1H; d; J= 10 Hz; H-17); 5.26(1H; m; J= 6 Hz, 3.6 Hz; H-12); 4.08(2H; d; J= 6 Hz; H-11); 3.80(3H; s; H-22); 1.83(3H; s; H-15); 1.69(3H; s; H-14); 1.46(6H; s; H-20, H-21). Phổ 13 C- NMR(500 MHz, CDCl3, ppm): 182(C-9); 159.91(C- 3); 157.96(C- 1); 156.31(C-4a); 155.77(C-10a); 154.56(C-6,7); 142.71(C-13); 137.04(C-8); 132.13(C-2); 127.13(C-17); 123.16(C-12); 115.74(C-16); 112.25(C-8a); 104.52(C-
9a); 77.94(C-18); 101.69(C-5); 94.16(C-4); 62.05(C-22); 28.33(C-20,21); 26.56(C-11); 25.79(C-15) và 18.21(C-14).
3.6. Thử hoạt tính sinh học.
3.6.1 Hoạt tính chống oxi hóa DPPH
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do đƣợc dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, đƣợc xác định bằng cách đo quang ở bƣớc sóng = 517 nm.
Cách tiến hành: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong Methanol (MeOH). Chất thử đƣợc pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt đƣợc một dãy các nồng độ 256; 64; 16; 4; 1 g/ml. Để thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chƣa phản ứng bằng máy đọc Genios Tecan ở bƣớc sóng 517 nm. % quét gốc tự do DPPH của mẫu thử đƣợc tính theo công thức sau:
SC% = (OD trắng – OD mẫu thử)/ ODtrắng (%).
EC50 đƣợc tính theo giá trị SC tƣơng quan với các nồng độ khác nhau của chất thử, thí nghiệm đƣợc lặp lại với n = 3.
Đƣờng chuẩn biểu thị mối tƣơng quan giữa nồng độ DPPH và mật độ quang học:
Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH y = 0.3225x + 0.0241 R2 = 0.9938 0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 1.4000 1.6000 1.8000 0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000 Nồng độ DPPH mM M ật đ ộ q u an g h ọ c (O D )
Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa DPPH đƣợc trình bày trong chƣơng 4: Kết quả và thảo luận.
3.6.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh
3.6.2.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đƣợc thực hiện dựa trên phƣơng pháp pha loãng đa nồng độ. Đây là phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (Minimum inhibitor concentration - nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (Inhibitor concentration 50% - nồng độ ức chế 50%), MBC (Minimum bactericidal concentration - nồng độ diệt khuẩn tối thiểu).
3.6.2.2. Các chủng vi sinh vật kiểm định
Bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở ngƣời do ATCC cung cấp:
- Bacillus subtilis (ATCC 6633): là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thƣờng không gây bệnh.
- Staphylococcus aureus (ATCC 13709): cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thƣơng, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng.
- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đƣờng ruột lên men có ích, thƣờng có mặt trong hệ tiêu hoá của ngƣời và động vật.
- Escherichia coli (ATCC 25922): vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đƣờng tiêu hoá nhƣ viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đƣờng tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột.
- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thƣơng hàn, nhiễm trùng đƣờng ruột ở ngƣời và động vật.
- Candida albicans (ATCC 10231): là nấm men, thƣờng gây bệnh tƣa lƣỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa.
3.6.2.3. Môi trường nuôi cấy
MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud-2% dextrose broth) và SA (Sabouraud-4% dextrose agar) cho nấm.
3.6.2.4. Cách tiến hành
- Pha loãng mẫu thử:
Mẫu ban đầu đƣợc pha loãng trong DMSO và nƣớc cất tiệt trùng thành một dãy 05 nồng độ theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết là 256g/ml và với chất sạch là 128g/ml.
Lấy 10l dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200l dung dịch vi khuẩn và nấm có nồng độ 5.105
CFU/ml, ủ ở 37oC/24h.
- Xử lý kết quả
+ Giá trị MIC đƣợc xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật.
+ Giá trị IC50 đƣợc tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trƣờng nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.
+ Giá trị MBC đƣợc xác định bằng đĩa thạch, trong đó có số khuẩn lạc tƣơng đƣơng với điều khiển (-).
- Chất tham khảo
+ Kháng sinh Ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram (+); chủng E.c và S.e
với giá trị IC50 trong khoảng 0,05-2g/ml.
+ Kháng sinh Pen/Step cho chủng Pa với giá trị IC50 trong khoảng 4-5g/ml. + Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5-1 g/ml.
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh đƣợc trình bày trong chƣơng 4: kết quả và thảo luận
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Điều chế các phần chiết
Các chất trong măng cụt đƣơc chiết theo nguyên tắc tăng dần độ phân cực. Đầu tiên, vỏ măng cụt đƣợc ngâm chiết với etanol. Tiếp theo, dịch chiết etanol và nƣớc đƣợc phân bố lần lƣợt với điclometan và n- Butanol.
Qui trình chiết các lớp chất trong vỏ quả măng cụt đƣợc tóm tắt trong sơ đồ 4.1.
Hiệu suất điều chế các phần chiết điclometan và n- Butanol từ vỏ măng cụt đƣợc nêu ra trong bảng 4.1
Bảng 4.1 Hiệu suất các phần chiết từ vỏ quả măng cụt
STT Cặn chiết Kí hiệu Khối lượng
(g)
Hiệu suất %*
1 Điclometan GMD 121,3 6.06 2 n- Butanol GMB 22,23 1.11
(*) Tính theo khối lƣợng mẫu khô ban đầu.
Kết quả trên cho thấy cặn điclometan có khối lƣợng lớn với hiệu suất hơn hẳn so với cặn n- Butanol. Đây cũng là một điều cần lƣu ý khi nghiên cứu, nhất là nghiên cứu với lƣợng lớn
Sơ đồ 4.1. Quy trình chiết các lớp chất trong vỏ quả măng cụt xanh
Vỏ quả măng cụt đã nghiền nhỏ (2,0 kg bột khô)
- Ngâm chiết với etanol 96% trong 4 lần ( 3 ngày/ lần)
- Lọc dịch chiết qua giấy lọc