b. Kiểm tra vi khuẩn trong nước sử dụng cho giết mổ * Phương pháp nuôi cấy xácđịnh TSVKH
3.5.3.3. Phát hiện và xácđịnh vi khuẩnSalmonella có trong 25g thịt
Áp dụng quy trình trong TCVN 5153 - 1990 ; tham khảo tài liệu của FAO (1992);
- Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu: TCVN 4833 - 1÷ 2 : 2002 .
- Nuôi cấy tăng sinh lựa chọn: cân 25g thịt (không lấy mỡ, bỏ mô liên kết) chuyển vào túi P.E chuyên dùng, bổ sung vừa đủ 225ml môi trường
Mullerkaufman (có thể dùng môi trường thay thế Rappaport, Tetrathionat natri hoặc Selenit), đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy Stomacher trong 1 phút, để tủ ấm 370C trong thời gian 24 - 48h.
- Phân lập trên môi trường chọn lọc: dùng que cấy vô trùng, lấy một vòng đầy canh trùng từ môi trường tăng sinh cấy chuyển sang đĩa môi trường thạch XLD (Xylose Lysine Deoxycholate agar).
- Đọc kết quả: nếu trên môi trường XLD, khuẩn lạc mọc màu hồng có chấm đen ở giữa thì nghi là khuẩn lạc của Salmonella. Lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy chuyển trên môi trường thạch máu để tủ ấm 370C/24h, chọn khuẩn lạc thuần tách biệt.
Làm phản ứng sinh vật hoá học để xác định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn như sau:
+ Khuẩn lạc nghi ngờ cấy trên môi trường tam đường sắt (TSI): dùng que cấy trên mặt thạch, sau đó cấy thẳng đứng sâu xuống đáy ống nghiệm, ủ 370C/24h đọc kết quả. Nếu là vi khuẩn Salmonella, mặt nghiêng ống môi trường TSI có màu đỏ (nghĩa là không phân giải lactose và sucrose); thân và đáy có màu vàng, có bọt khí và vết nứt (phân giải glucose, sinh hơi), có màu đen (sinh H2S).
+ Nuôi cấy trên môi trường urê (Christensen): cấy trên mặt nghiêng thạch, ủ 370C/24h. Salmonella có phản ứng âm tính, môi trường không chuyển màu (dương tính màu đỏ).
+ Nuôi cấy trên môi trường Lysin decacboxylas: phản ứng dương tính màu tím (âm tính màu vàng).
+ Thử Beta - Galactosidas (O.N.P.G): nhỏ 1 giọt Toluen vào ống nghiệm chứa hỗn dịch 0,25 ml nuớc muối đẳng trương với khuẩn lạc; lắc đều, ủ cách thủy 370C trong 15 phút; nhỏ tiếp 0,25 ml thuốc thử, lắc đều, tiếp tục ủ cách thuỷ 370C trong 24h. Đọc kết quả Salmonella có phản ứng âm tính, không chuyển màu (dương tính màu vàng).
+ Thử phản ứng Indol: cấy vi khuẩn vào môi trường pepton, ủ 370C từ 24 - 48h, sau nhỏ 1 ml thuốc thử, đọc kết quả. Salmonella có phản ứng âm tính (-) màu vàng nhạt, dương tính (+) màu đỏ.
+ Thử phản ứng VP (Voges - Proskauer): cấy vi khuẩn vào môi trường pepton glucose, ủ 370C trong 48h. Chuyển 1 ml canh trùng vào 1 ống nghiệm khác và bổ sung 0,6 ml dung dịch cồn Anpha naptol, 0,2 ml Kalihydroxyt 40%, lắc đều đọc kết quả sau 5 -15 phút. Salmonella có phản ứng (-), không màu hoặc vàng nhạt; dương tính (+), màu đỏ.