Võ Thế Dũng và cộng sự (2011) đã công bố 3 loài ký sinh trùng gây bệnh trên cá tầm là Trichodina sp., Gyrodactylus sp.và Ichthyophthyrius multifilis, một loài nấm
Saprolegnia sp., và 6 loài vi khuẩn là Aeromonas hydrophila, Pseudomonas cepacia, Streptococus sp., Enterobacter sakazaki, Vibrio cholerae, Serratia odorifera khi nghiên cứu 27 mẫu cá tầm bị bệnh xuất huyết nuôi ở Lâm Đồng.
Theo công trình khác của Võ Thế Dũng và cs (2012), đã xác định các tác nhân gây bệnh trên cá tầm được nuôi trong ao và trong lồng tại Lâm Đồng trên hai đối tượng cá tầm Nga và cá tầm Siberi bao gồm ký sinh trùng, vi khuẩn và nấm. Tác nhân là ký sinh trùng bao gồm Trichodina sp. và Ichthyophthirius multifiliis là 2 loài phổ biến trên da và mang của cá với tỷ lệ nhiễm và số lần bắt gặp trong năm cao hơn so với Gyrodactylus sp. Cũng theo báo cáo này, kết quả phân lập từ cá tầm bị bệnh xuất huyết, lở loét đã xác định được 9 loài vi khuẩn là Aeromonas hydrophila, Yersinia ruckeri, Burkholderia cepacia, Streptococcus sp.,Vibrio cholerae, Enterobacter sakazakii, Serratia plymuthica, Serratia odorifera, Hafnia alvei với tần số bắt gặp cao nhất ở 3 loài A. hydrophila, B. cepacia, Streptococcus sp. từ cá tầm nuôi ao và 6 loài vi khuẩn là A. hydrophila, B. cepacia, Streptococcus sp., V. cholerae, E. Sakazakii, S. odorifera với tần số bắt gặp cao nhất là 3 loài A. hydrophila, B. cepacia, Streptococcus sp. từ cá tầm nuôi lồng. Tác nhân là nấm gây bệnh lở loét, xuất huyết kèm theo những vết trắng loang lổ trên thân được phân lập được 2 loài là Saprolegnia sp2 và Aphanomyces sp. trên cá tầm nuôi ao và 1 loài
Saprolegnia sp2 trên cá tầm bệnh nuôi lồng, trong đó tần số bắt gặp của Saprolegnia sp2 cao hơn.
CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, thời gian và địa điểm nghiên cứu:
Đối tượng: nghiên cứu cá tầm giống ương nuôi tại Lâm Đồng gồm: Cá tầm Nga: Acipenser gueldenstaedtii
Cá tầm Siberi: Acipenser baerii
Bảng 2.1. Các thông số về số lượng, chiều dài và khối lượng mẫu
Thông số Ký sinh trùng Vi khuẩn Nấm Cá tầm Nga Cá tầm Siberi Cá tầm Nga Cá tầm Siberi Cá tầm Nga Cá tầm Siberi Số lƣợng 128 118 49 32 19 20 Chiều dài (mm) 117 ± 4,5 106 ± 1,6 127 ± 10,3 105 ± 2,4 131 ± 14,6 129 ± 4,8 Khối lƣợng (g) 18 ± 4,1 15 ± 0,9 33 ± 10,1 13 ± 1,7 22 ± 8,7 23 ± 2,5
Ghi chú: Số liệu được trình bày dưới dạng TB ± SD.
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 11/2013 đến 6/2014 Địa điểm nghiên cứu:
Mẫu thu tại Klong Klanh, Tuyền Lâm, Giang ly, trại ông Nguyễn Viết Thùy, Đà Lạt nơi ương nuôi cá tầm giống ở tỉnh Lâm Đồng.
Phân tích thành phần các tác nhân và thí nghiệm trị bệnh tại Phòng sinh học thực nghiệm – Viện NCNTTS III.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu: Phƣơng pháp thu mẫu cá:
- Tiến hành thu mẫu hàng tháng tại một số trại ương nuôi cá tầm giống ở Lâm Đồng.
- Thu mẫu: theo phương pháp thu mẫu chọn lọc, thu các mẫu cá có những biểu hiện bất thường như cá yếu, hay cọ xát vào vật thể trong bể, tối màu,
xuất huyết ngoài da, vây,... Mẫu sau khi thu được giữ và đóng túi có bơm oxy ở nhiệt độ 20 - 220C, sau đó vận chuyển cá về phòng thí nghiêm để tiến hành kiểm tra và phân tích.
2.2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu bệnh do kí sinh trùng:
Sử dụng phương pháp nghiên cứu toàn diện KST trên cá của Dolgiel. Mẫu cá sau khi thu được đo chiều dài (mm) và cân trọng lượng (g), sau đó kiểm tra nội và ngoại KST. Những mẫu KST được cố định, làm tiêu bản, bảo quản và tiến hành phân loại.
2.2.1.1. Phƣơng pháp kiểm tra và phát hiện ký sinh trùng:
Phƣơng pháp thu và xử lý mẫu:
Hình 2.1. Sơ đồ khối nghiên cứu ký sinh trùng Chụp ảnh, vẽ, đo kích thước, đếm
Phân loại KST
Kiểm tra KST ngoại ký sinh Giải phẫu kiểm tra KST nội ký sinh Mẫu cá nghiên cứu
Tiêu bản tươi Tiêu bản cố định
Quan sát KST dưới kính soi nổi, kính hiển vi, mô tả đặc điểm
Mẫu cá sống được cho vào thùng xốp đựng nước ngọt có sục khí, vận chuyển về phòng thí nghiệm để phân tích. Khi thu mẫu kết hợp ghi chép các thông tin về thời gian, địa điểm thu mẫu. Kiểm tra phát hiện KST ngoại ký sinh, nội ký sinh và thu thập mẫu KST. Cân khối lượng và đo chiều dài cá.
Sử dụng một số tài liệu để phân loại KST: ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam của Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007),Võ Thế Dũng và cs (2012).
Các bƣớc tiến hành thu mẫu ký sinh trùng:
- Quan sát bên ngoài cơ thể cá để phát hiện nhanh một số KST có kích thước lớn như: đỉa cá, giáp xác,...
- Cạo nhớt da và dàn đều trên kính. Đem quan sát dưới kính hiển vi (4x10, 10x10) để kiểm tra phát hiện KST.
- Dùng xiranh hút máu từ tim cá, dàn đều lên lam đem soi tươi hoặc làm tiêu bản nhuộm để quan sát dưới kính hiển vi.
- Cắt các vây, xương nắp mang và từng lá mang, bỏ vào các hộp lồng có chứa nước ngọt lọc sạch. Quan sát KST dưới kính soi nổi. Tách KST đưa lên lam kính, đậy lamen và quan sát dưới kính hiển vi (4x10, 10x10).
- Mổ cá, quan sát cơ quan nội tạng tìm KST.
- Tách túi mật, làm tiêu bản dịch mật rồi tiến hành quan sát dưới kính hiển vi. - Kiểm tra KST dưới kính soi nổi của ruột và dạ dày. Tách KST đưa lên lam và
đậy lamen, quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại phù hợp.
- Đối với gan, thận, não; đặt lên lam kính, dàn mỏng rồi quan sát dưới kính hiển vi.
Phƣơng pháp làm tiêu bản và phân loại các nhóm ký sinh trùng: a. Sán lá đơn chủ
- Tách chúng ra khỏi ký chủ, cho vào hộp lồng chứa nước ngọt lọc sạch. - Nghiên cứu trùng sống:
+ Đặt trùng lên lam kính, nhỏ giọt nước muối sinh lý rồi quan sát dưới kính hiển vi.
- Làm tiêu bản cố định:
+ Tách sán, đưa lên lam kính, rửa sạch bằng nước muối sinh lý.
+ Tiến hành cố định và rút nước trong cơ thể sán bằng Glacial acetic acid lần lượt 1 giọt và 1–2 giọt.
+ Gắn bằng nhựa Canada Balsam.
- Phân loại: chủ yếu dựa vào các đặc điểm như hình dạng cơ thể, cấu tạo, kích thước của các cơ quan bám, cơ quan sinh dục.
b. Động vật nguyên sinh:
- Nghiên cứu trùng sống (tiêu bản tươi):
+ Cạo nhớt hoặc lấy dịch mật, dịch mắt hoặc ép gan, thận,... + Xem dưới kính hiển vi với độ phóng đại 10x10 hoặc 40x10.
Nhuộm tiêu bản cố định: có 2 cách là nhuộm bằng Hematociline và nhuộm bằng Nitrate Bạc (AgNO3) theo phương pháp Klein (Lom và Dyková, 1992). Phƣơng pháp nhuộm:
Nhuộm bằng Nitrate Bạc (AgNO3):
+ Lấy lam có trùng xếp một lượt vào chậu thủy tinh (để mặt có trùng lên trên) dùng congtogut nhỏ AgNO3 2% đều lên khắp mặt lam.
Lấy mẫu ra rửa bằng nước sạch nhiều lần. Tiếp tục ngâm mẫu trong nước ngập sâu 1–1,5 cm, đem phơi nắng khoảng chừng 30–60 phút tùy theo cường độ ánh sáng mặt trời.
+ Rửa lại nước cất nhiều lần, dựng nghiêng cho khô.
+ Quan sát dưới kính hiển vi, gắn tiêu bản bằng nhựa Canada Balsam. Có thể dùng Glycerin – Gelatin để gắn tiêu bản nhưng với điều kiện khí hậu nóng ẩm của Việt Nam rất dễ bị mốc và hỏng tiêu bản.
+ Dán nhãn ghi rõ thông tin và bảo quản mẫu.
Ưu điểm của phương pháp này là vòng răng trên cơ thể trùng được nhìn thấy rõ thuận lợi cho quá trình phân loại.
- Phân loại động vật đơn bào: quan sát các tiêu bản (tươi hoặc cố định) dưới kính hiển vi với độ phóng đại thích hợp. Chụp hình, vẽ, đo, đếm các chỉ tiêu phân loại. Đếm số lượng mỗi loài trên từng thị trường hoặc trên cả lam kính.
+ Phân loại Trichodina: dựa vào số lượng, hình dạng, kích thước răng, đường kính cơ thể và vòng đồng tâm.
+ Phân loại Ceratomyxa: dựa vào hình dạng và kích thước cơ thể (chiều dài, đường kính và tỷ lệ giữa khoảng từ điểm giữa ra đến mút của cánh so với đường ngang thân); hình dạng và vị trí của cực nang.
+ Phân loại Ichthyophthyrius: dựa vào hình dạng, nhân, kích thước cơ thể.
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn:
Dựa theo phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn cá và động vật thủy sản của Frerichs (1993), Plumb & Bowser, Bùi Quang Tề (1995), Đỗ Thị Hòa (2005), tham khảo phương pháp nghiên cứu được mô tả trong Võ Thế Dũng và ctv (2012).
Nhuộm gram Kết luận Định danh vi khuẩn Mẫu cá Thu mẫu bệnh phẩm
Nuôi cấy thuần Nuôi cấy phân lập
Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc
Thử phản ứng sinh hóa
2.2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn:
Môi trường phân lập:
Môi trường:
- Môi trường nuôi cấy cơ bản: TSA (Tryptic Soy Agar) không có muối NaCl, NB (Nutrient Broth)
- Môi trường dùng cho thử các phản ứng sinh hóa: Bộ kít API 20E, API 20STREP (bioMrieux, Pháp)
- O/F môi trường cơ bản để kiểm tra khả năng lên men và oxy hóa. - Manitol môi trường thử khả năng di động.
Hóa chất:
- Hóa chất dùng nhuộm Gram vi khuẩn: crystal, lugol, cồn acetol, fuchsin. - Nước muối sinh lý, cồn 700
.
Nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn:
Mẫu bệnh phẩm (gan, thận, lách, vết loét) lấy từ cá bệnh, được rửa lại 2–3 lần bằng nước muối sinh lý 0,85%, sau đó cho vào ống nghiệm vô trùng và tán nhuyễn bằng đũa thủy tinh. Dùng que cấy đã vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy bệnh phẩm cấy lên đĩa thạch chứa môi trường TSA. Cho đĩa thạch vào tủ ấm và quan sát kết quả sau 24 giờ, yêu cầu trên bề mặt đĩa thạch phải xuất hiện các khuẩn lạc rời nhau. Dựa vào hình dạng, màu sắc và kích thước khuẩn lạc để làm cơ sở xác định loài nghiên cứu.
Nuôi cấy loài thuần:
Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ và chiếm ưu thế trên bề mặt các đĩa thạch phân lập để nuôi cấy thuần. Dùng que cấy vô trùng để cấy thuần chuyển sang đĩa thạch khác, mục đích tạo số lượng lớn vi khuẩn để chuẩn bị cho việc thử các phản ứng sinh hóa làm cơ sở
cho việc định danh vi khuẩn hoặc chuyển sang lưu giữ trong trong ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng TSA có nút đậy tiệt trùng. Không được dùng loài đã cấy chuyển quá 5 lần để hạn chế sự thoái hóa và suy giảm độc lực của loài vi khuẩn cần sử dụng.
Lưu giữ loài thuần:
- Lưu giữ trong môi trường lỏng: dùng Micropipet lấy khoảng 1ml dung dịch môi trường vào ống Ependord chứa môi trường NB (có chứa 20% Glycerol) rồi dùng que cấy lấy 1 khúm nhỏ khuẩn lạc vi khuẩn đã cấy thuần khuấy đều trong ống. Để trong tủ ấm lắc trong khoảng 100 vòng/phút, sau 24 giờ đem lưu giữ trong tủ đông sâu –800C. Chủng được lưu giữ bằng phương pháp này có thể dùng được đến 2 năm.
- Môi trường thạch nghiêng (TSA): dùng que cấy đầu tròn lấy 1 khúm khuẩn lạc từ đĩa thạch đã được cấy thuần ria đều trên mặt thạch nghiêng, để trong tủ ấm 24 giờ cho vi khuẩn mọc đều rồi đem lưu giữ trong tủ lạnh. Bọc các ống nghiệm này trong giấy bạc và túi nhựa vô trùng, bảo quản ở nhiệt độ 5 – 70C để lưu giống định danh sau. Chủng được lưu giữ bằng phương pháp này có thể dùng được trong vòng 6 tháng.
Nhuộm Gram để quan sát hình thái vi khuẩn: theo phương pháp của Plumb & Bowser (1983).
- Nhằm mục đích xác định được hình thái, cách sắp xếp và đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn thông qua khả năng bắt màu thuốc nhuộm để xác đinh vi khuẩn là Gram dương (bắt màu tím xanh) hay Gram âm (bắt màu hồng).
- Phương pháp: sau khi dùng que cấy đầu tròn đã vô trùng, lấy vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy lỏng hay từ khuẩn lạc, hoặc từ các mô cá bệnh, dàn đều thành một lớp mỏng trên lam kính sạch cùng với một giọt nước muối sinh lý, để mẫu khô ở nhiệt độ phòng sau đó hơ cao tấm lam trên ngọn lửa đèn cồn để làm chết vi khuẩn và gắn chúng vào lam, ghi etiket, sau đó tiến hành làm theo lần lượt các bước sau:
Nhỏ dung dịch tím Crystal lên tiêu bản, để 60 giây.
Nhỏ dung dịch Lugol trong 1 phút.
Rửa nước nhanh, vẩy khô nước.
Nhỏ dung dịch Cồn – Aceton, nghiêng lam cho cồn chảy qua lam kính để tẩy màu.
Rửa nhanh nước và vẩy cho khô.
Nhỏ dung dịch Fuchsin trong 1 – 2 phút.
Rửa nước, để khô tự nhiên (có thể dùng giấy thấm khô nhưng không làm xước mẫu).
Dùng kính hiển vi có vật kính 100x để quan sát tiêu bản Vi khuẩn có màu xanh tím – Gram dương (+).
Vi khuẩn có màu đỏ hồng – Gram âm (–). – Định danh vi khuẩn bằng test API 20E.
Thực hiện dãy các phản ứng sinh hóa bằng test kit API–20E Và API–20STREP (Analytical Profile Index) để xác định đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn:
1. Oxidase 2. Catalase 3. ONPG 4. ADH (Arginine) 5. LDC (Lysine) 6. ODC (ornithine) 7. CIT (Citrate) 8. H2S 9. URE (Urea) 10. TDA (Tryptophane) 11. IND (Indol) 12. VP 13. GEL (Gelatine) 14. GLU (Glucose) 15. MAN (Malnitole) 16. INO (Inositole) 17. SOR (Sorbitole) 18. RHA (Rhaminose) 19. SAC (Sucrose) 20. MEL (Melibiose ) 21.AMY(Amygdalin) 22. ARA (Arabinose) 23. NO2 (khử nitrate)
Kết quả định danh dựa vào kết quả dãy phản ứng sinh hóa, bảng tra kết quả API – 20E, API – 20SSTREP và hệ thống phân loại vi khuẩn của Frerichs (1993), Holt và cs (1994).
- Theo tài liệu của Alexopoulos (1962), Bùi Quang Tề (1995, 1997), Đỗ Thị Hòa và ctv (2003, 2004), Võ Thế Dũng và ctv (2012).
2.2.3.1. Môi trƣờng nuôi cấy nấm:
- Môi trường PDA không muối (Patato Dextrose Agar): 3,9g/100ml.
2.2.3.2. Phƣơng pháp nuôi cấy và phân loại nấm:
Hình 2.3. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu bệnh do nấm Cấy sang môi trường
PDA không muối
Quan sát đặc điểm bào tử đính Phân loại Xác định đặc điểm hình thái, sinh sản Thu mẫu Soi tươi mẫu
Cấy mẫu
Nuôi cấy thuần bằng phương pháp một bào tử Nuôi cấy trên môi trường PDA không muối 22–250C
- Mẫu được đưa về phòng thí nghiệm, tiến hành kiểm tra sự nhiễm nấm bằng phương pháp soi tươi dưới kính hiển vi.
- Cách xử lý:
Mẫu cá giống:
+ Cắt mẫu bệnh phẩm (mang, cơ) nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên, đặt lamen trên mẫu rồi soi dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 100 và 400 lần) để kiểm tra nhiễm nấm.
+ Cấy mẫu vào môi trường PDA có bổ sung 500µm/ml kháng sinh Peniciline & Streptomycin (để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn). Dụng cụ phải được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn để tránh lẫn tạp trong quá trình nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy ở 250C, sau 2 – 4 ngày quan sát sự phát triển của khuẩn lạc, giống nấm sẽ được thuần loài theo phương pháp nuôi cấy một bào tử.
Phƣơng pháp nuôi cấy nấm thuần chủng một tế bào:
Đây là phương pháp nuôi cấy tạo ra một loại khuẩn lạc thuần, từ đó có thể quan sát các đặc điểm, hình thái của loài nấm đang nghiên cứu để phân loại.
Từ đĩa môi trường chứa khuẩn lạc, pha loãng thành dung dịch bào tử nấm bằng nước muối sinh lý đến tỷ lệ 3 bào tử/giọt; sau đó, dùng ống hút vô trùng lấy 0,1 ml dung dịch trên chuyển sang đĩa môi trường PDA. Dùng que cấy đã vô trùng trang đều trên môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp 15 – 220
C trong 24 giờ. Chọn những khuẩn lạc rời trên môi trường nuôi cấy để lưu giữ thuần chủng.
Phƣơng pháp phân loại nấm:
Phân loại nấm: Lấy mẫu sợi nấm soi tươi hoặc nhuộm Xanh Malachite. Quan sát hình dạng, đặc điểm của khuẩn ty, bào tử và dựa vào tài liệu phân loại để xác định.
Phân loại nấm bậc thấp áp dụng phương pháp của Ainsworth (1973); Frederick và ctv (1969).
Phân loại nấm bậc cao áp dụng phương pháp của Booth (1971). Phƣơng pháp xác định kích thƣớc hiển vi của nấm:
Tiến hành đo kích thước: đường kính sợi nấm, bào tử, túi bào tử...
2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu:
Phương pháp thu thập số liệu: