Từ mẫu, phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của cá bệnh, nuôi cấy trên môi trường TSA ở nhiệt độ 250C, sau 24 – 28 giờ, nhuộm gram cùng với một số phản ứng sinh hóa, đã phân lập được 3 loài. Kết quả trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.7. Thành phần các loài vi khuẩn phân lập từ cá tầm giống bị bệnh xuất huyết
Ngành Lớp Bộ Họ Giống Loài Proteobacteria Gammaproteo –bacteria Aeromon –adales Aeromonada –ceae Aeromonas A. hydrophila Aeromonas A. salmonicida Pseudom –onadales Pseudomona
–daceae Pseudomonas P. luteola
Các nhóm vi khuẩn được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm xuất huyết ở cá tầm giống Nga và cá tầm Siberi thu tại Lâm Đồng, có hai loài thuộc giống Aeromonas, đây là nhóm vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng máu với các dấu hiệu điển hình như xuất huyết, lở loét trên thân và nội tạng, thường gặp trên các đối tượng thủy sản nước ngọt. Vi khuẩn P. luteola thuộc giống Pseudomonas, giống gây bênh xuất huyết chủ yếu trên cá nước ngọt (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004) cũng được tìm thấy trên cá tầm giống.
3.2.2. Đặc điểm các loài vi khuẩn phân lập đƣợc từ cá tầm giống: 3.2.2.1. Đặc điểm sinh hóa của các loài vi khuẩn:
Kết kiểm tra phản ứng sinh hóa của các loại vi khuẩn phân lập trên cá tầm có dấu hiệu của bệnh xuất huyết tương đồng với các nghiên cứu của nhiều tác giả. Vi khuẩn
Aeromonas hydrophyla và A. salmonicida đều phản ứng dương tính với oxidase, catalase;
Pseudomonas luteola phản ứng âm tính với oxidase, catalase. Kết quả này giống với một số tác giả nghiên cứu trước.
Bảng 3.8. Đặc điểm sinh hóa của một số loài vi khuẩn phân lập từ cá tầm giống bị bệnh thu tại Lâm Đồng ĐĐSH Aeromonas hydrophyla Aeromonas hydrophyla* Aeromonas salmonicida Aeromonas salmonicida** Pseudomonas luteola Pseudomonas luteola*** Hình khuẩn lạc Tròn, nhẵn, d=1,5–2mm Tròn, d ≤ 0,5 mm Tròn , d ≤ 0,5mm Màu KL (trên TSA) Trắng, hơi
bóng n.a Trắng đục n.a Trắng đục, hơi bóng n.a Gram – – – – – – Di động + + – – + + OPNG + + – – + ADH + + – – + + LDC D – – – – – ODC – – – – – – CIT + + – – + + H2S – – – – – – URE – – – – – – TDA – – – – – – IND + + – – – – VP – + + + – – GEL + + D + – +
GLU + + + + D + MAN + + D – + + INO – – – – + + SOR – – – – + + RHA – – – – – – SAC + + – + D + MEL – – – – – – AMY + – – – – – ARA + – – – – – OXI + + + + – – NO2 + + – + – – N2 – n.a – n.a – – OF – F + n.a + D – – OF – O + n.a + n.a – –
Ghi chú: +: phản ứng dương tính; –: phản ứng âm tính; D: có sự sai khác giữa các lần kiểm tra; n.a: không đề cập.
*
3.2.2.2. Đặc điểm một số loài vi khuẩn phân lập đƣợc trên cá tầm giống:
Aeromonas hydrophyla
Aeromonas hydrophyla bắt gặp nhiều trên các đối tượng cá nước ngọt, thường gây bệnh nguy hiểm cho đối tượng nuôi (NOGA, 2000, Prearovà cs, 2009). Cá bị nhiễm loài vi khuẩn này, có các dấu hiệu đặc trưng như: da cá sẫm màu, xuất hiện các điểm xuất huyết trên thân, ban đầu ở phần bụng, trên các vây sau đó lan dần đến phần đầu, ăn yếu, sau đó bỏ ăn. Gan cá sẫm màu, một số con gan trắng nhợt, cá bị nhiễm nặng kèm theo xuất huyết nhiều trên gan. Cá chết rãi rác ở thời kỳ đầu mới nhiễm bệnh, sau một thời gian cá chết 100%. Vi khuẩn A. hydrophyla còn bắt gặp và gây bệnh trên cá tầm thương phẩm (Võ Thế Dũng và cs, 2011, 2012).
A. hydrophyla là vi khuẩn gram âm, dạng hình que, khuẩn lạc tròn, bề mặt dạng lồi, màu trắng đục hay màu trắng kem hơi bóng, đường kính 1,5 – 2,0mm. Vi khuẩn này có tính di động, kích thước 0,5–0,8x1,5–3,5µm (Timur, 2009).
Cơ chế gây độc của Aeromonas hydrophyla được trình bày khá rõ trong báo cáo của Sundus và cs (2012). Theo báo cáo này, các tổn thương gây ra trên cá như xuất huyết, hoại tử là do loài vi khuẩn này sản sinh ra độc tố. Một số yếu tố gây độc được ghi nhận như nhiễm trùng máu, tan máu, nhiễm độc tế bào và nhiễm độc đường ruột (enterotoxin, đây là ngoại độc tố do vi khuẩn tiết ra). Độc tố của vi khuẩn A. hydrophyla bao gồm các enzyme như protease và elastase. Vi khuẩn này sản sinh ra typ β– hemolysin trên đĩa thạch máu, một chất gây tiêu máu, tán huyết bằng cách tiêu tế bào máu. Nhiễm trùng A. hydrophyla sản sinh ra lượng lớn β–hemolysin, gây nên hiện tượng thiếu máu cho cá. Cá bị nhiễm loài vi khuẩn này nếu không được kiếm soát kịp thời sẽ gây ra những tổn thương xuất huyết, hoại tử nghiêm trọng. (Kanat, 1984; Wang, 2003; Chopra, 1999; Fish health section, 1975; Miyazaki, 1985).
Hình 3.8. Aeromonas hydrophyla Hình 3.9. Vi khuẩn Gram (–)
Aeromonas salmonicida
Areomonas salmonicida là loài vi khuẩn gây bệnh cho cá thường gặp nhất
trong số các loài Areomonas không di động. Vi khuẩn này lây nhiễm và gây bệnh cho cá
với những dấu hiệu xuất huyết, lở loét trên thân và vây. Ở Việt Nam, Đỗ Thị Hòa (2004) đã bắt gặp vi khuẩn A. salmonicida gây bệnh xuất huyết trên cá diếc Cyprinus auratus.
Khuẩn lạc vi khuẩn A. salmonicida màu trắng đục, tròn, đường kính ≤ 0,5 mm. Đây là vi khuẩn gram âm, dạng hình que ngắn, không có tiêm mao nên không có tính di động.
Trên cá tầm, vi khuẩn có những dấu hiệu tương tự như xuất huyết trên da, gốc vây và vây, xung quanh miệng, sau đó tiến triển thành các vết loét, gây thủng thành lỗ. Giải phẫu bên trong nội tạng xuất hiện các điểm xuất huyết trên gan.
Hình 3.7. Vây cá tầm bị nhiễm vi khuẩn
Hình 3.13. Vi khuẩn Gram (–) Hình 3.12. Aeromonas salmonicida
Pseudomonas luteola
Pseudomonas luteola hay còn gọi là Chryseomonas luteola được biết đến như là tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn đường huyết (bacteraemia), đặc biệt trên các bệnh nhân bị suy giảm hệ miễn dịch (Anzai và cs, 1997; Kiska và cs, 1999). Đối với cá và các đối tượng thủy sản khác, ít tìm thấy P. luteola gây bệnh. Altinok (2007) lần đầu tiên báo cáo
P. luteola là tác nhân gây bệnh cho cá hồi vân giống cỡ 10 – 40g, đã gây chết hơn 40% đàn cá nhiễm bệnh.
Cá bị nhiễm P. luteola với các dấu hiệu bên ngoài như cơ thể sẫm màu, gây xuất huyết ở phần da, vây của cá. Giải phẫu bên trong với các dấu hiệu như lách, gan nhợt nhạt, dạ dày trống rỗng, ruột chứa đầy chất lỏng.
Hình 3.8. Đặc điểm sinh hóa của A. salmonicida trên test kit API 20E
P. luteola là vi khuẩn gram âm, có dạng hình que, di động, kích thước từ 0,8μm đến 2,5μm. Vi khuẩn này được nuôi cấy trên môi trường TSA không muối ở nhiệt độ 300
C trong 2 ngày, khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, hơi bóng, nhỏ li ti (đường kính ≤ 0,5 mm).
3.2.2.3. Tần số bắt gặp của một số loài vi khuẩn:
Bảng 3.2. Tần số bắt gặp của các loài vi khuẩn trên cá tầm Nga và cá tầm Siberi
Tên loài vi
khuẩn Cá tầm Nga (n=49) Cá tầm Siberi (n=32)
TSBG Tỷ lệ (%) TSBG Tỷ lệ (%)
A. hydrophyla 33/49 67,3 21/32 65,6
A. Salmonicida 1/49 2,0 1/32 3,1
P. luteola 4/49 8,2 4/32 12,5
Hình 3.16. Pseudomonas luteola Hình 3.10. Vi khuẩn Gram (–)
Từ bảng số liệu trên cho thấy, các mẫu cá Nga và cá tầm Siberi bị nhiễm với các loài vi khuẩn với tần số bắt gặp có sự khác nhau trong thời gian thu mẫu. A. hydrophyla
bắt gặp với tần số cao nhất ở cá tầm Nga (33/49) và cá tầm Siberi (21/32). Có 4 mẫu cá nhiễm P. luteola được tìm thấy, số mẫu bắt gặp loài vi khuẩn A. salmonicida chỉ là 1 mẫu ở cả 2 loài cá tầm. Theo Võ Thế Dũng và cs (2012), thường xuyên bắt gặp loài vi khuẩn
A. hydrophyla với TSBG cao hơn so với các loài vi khuẩn khác phân lập từ cá tầm bị xuất huyết (21/34 mẫu cá tầm Nga, 13/22 mẫu cá tầm Siberi).
A. hydrophyla là loài vi khuẩn đặc trưng gây bệnh xuất huyết trên động vật thủy sản, vi khuẩn thuộc nhóm Aeromonas có khả năng vận động, do vậy khả năng lây lan theo trục ngang là rất nhanh trong môi trường nước nuôi nếu như không có biện pháp cách ly đàn cá bệnh kịp thời. Theo Đỗ Thị Hòa và cs (2004), bệnh do vi khuẩn thuộc nhóm
Aeromonas spp. có tỷ lệ tử vong từ 30 – 70%, ở cá trê, ba ba tỷ lệ này có thể lên đến 100% ở giai đoạn giống. Ngoài ra, vi khuẩn A. hydrophyla cũng là mối đe dọa lớn, nhất là giai đoạn cá giống của nhiều loài thủy sản nước ngọt của nhiều quốc gia như Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan,... vi khuẩn A. hydrophyla cũng được nhiều tác giả phân lập được từ nhóm cá bị xuất huyết ở trên cá tầm. Soltani và cs (2001) đã tìm thấy vi khuẩn này trên cá tầm Ba Tư giống xuất huyết ở phía Bắc Iran. A. hydrophyla cũng gây tử vong khoảng 10% trên cá tầm Siberi giống phân lập từ mẫu cá bị xuất huyết nuôi ở Pháp (Vuillaume và cs, 1987). Zaharia (2008), cũng đã định danh được loài vi khuẩn A. hydrophyla gây bệnh xuất huyết, lở loét trên cá tầm Nga giai đoạn giống.
Trong thời gian nghiên cứu, A. salmonicida và P. luteola bên cạnh A. hydrophyla
được phân lập từ nhóm cá bị xuất huyết trên cả cá tầm Nga và Siberi thu tại Lâm Đồng. So với A. hydrophyla, TSBG của 2 loài vi khuẩn này là thấp. Ghi nhận từ Cipriano (1996), khi tác giả tiến hành lây nhiễm A. salmonicida, một tác nhân được biết đến gây bệnh nhọt, trên cá tầm Đại tây dương được phân lập từ cá hồi sông bị nhiễm loài vi khuẩn này. Kết quả cho thấy vi khuẩn A. salmonicida có khả năng lây nhiễm và gây bệnh trên cá tầm Đại Tây Dương. Mohler (2003) cũng ghi nhận những dấu hiệu đặc trưng của bệnh do
vi khuẩn này gây ra như xuất huyết, lở loét ở mặt lưng và bụng cũng như xung quanh miệng của cá tầm Đại tây dương. Trên cá hồi (Oncorhynchus mykiss) cũng đã phân lập được vi khuẩn A. salmonicida. Loài vi khuẩn đặc trưng gây bệnh xuất huyết, lở loét (Docan và cs, 2012). Ở Việt Nam, A. salmonicida gây bệnh xuất huyết lở loét ở cá hồi với các biểu hiện như xuất huyết da, vây, nội quan với tần số bắt gặp tương đối cao 5/12 mẫu (Võ Thế Dũng và cs, 2011). Ngoài ra cũng tìm thấy loài vi khuẩn này trên cá diếc (Cyprinus auratus) bị lở loét (Đỗ Thị Hòa, 2004). P. luteola cũng được tìm thấy trong nhóm cá tầm giống bị xuất huyết thu tại Lâm Đồng. Vi khuẩn này được biết liên quan đến nhiễm trùng lâm sàn trên người (Connor và cs, 1987; Hawkins và cs, 1991). Theo báo cáo của Altinok và cs (2007), P. luteola được xác định là tác nhân gây bệnh cho cá hồi (Oncorhynchus mykiss) giống nuôi tại Thổ Nhĩ Kỳ. P. luteola cũng được phân lập từ ruột của cá chép (Cyprinus carpio) (Faragi và cs., 2012). Ở Việt Nam chưa có báo cáo về loài vi khuẩn gây bệnh trên cá.
Một số biện pháp phòng và trị bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá được một số tác giả đưa ra. Thuốc kháng sinh được xem là trị bệnh hiệu quả đối với tác nhân là vi khuẩn. Angelica Docan (2011), trong điều trị bệnh do vi khuẩn A. salmonicida cho cá hồi vân giống, sử dụng Chloramphenicol tắm cho cá với liều lượng 900 ppm trong thời gian 6 giờ liên tục trong 7 ngày cho hiệu quả trị bệnh cao (87%), hoặc sử dụng Kanamycin hay Streptomycin với nồng độ là 100 ppm cho 1kg cá bằng phương pháp tiêm bắp thịt cũng cho hiệu quả cao. Theo Zaharia (2008) có thể điều trị bệnh do vi khuẩn A. Hydrophila cho cá tầm Nga bằng cách sử dụng Oxytetracyline (98%) dạng bột, với liều lượng 50 mg/kg cá (5 g/kg thức ăn) trong 7 ngày. Điều trị bằng Tetracicline và Cloramfenicol cũng cho hiệu quả tốt, với liều dùng tương tự như khi sử dụng Oxytetracyline (98%). Đỗ Thị Hòa (2004), cá giống tắm với NaCl 2 – 4%; CuSO4 3 – 7 ppm có hiệu quả trong phòng bệnh do vi khuẩn Aeromonas spp. Võ Thế Dũng và cs (2011) cho biết, có thể điều trị bệnh xuất huyết, lở loét trên cá hồi bằng cách tiến hành ngâm cá với Oxytetracyline ở nồng độ 3 ppm hoặc 5 ppm có thể làm giảm tỉ lệ chết (15 – 25%) so với lô đối chứng, tỉ lệ cá chết là 35–65%.
3.3. Thành phần nấm có khả năng gây bệnh trên cá tầm giống: 3.3.1. Dấu hiệu bệnh lý và thành phần nấm bắt gặp: 3.3.1. Dấu hiệu bệnh lý và thành phần nấm bắt gặp:
Cá tầm bị nhiễm nấm, trên thân thấy xuất hiện các đốm tròn dạng bông, tại chỗ có hiện diện của các đám dạng bông này thấy hoại tử lớp da, dần có dấu hiệu lở loét.
Từ các mẫu cá bị bệnh, theo phương pháp thu mẫu chọn lọc, tiến hành lấy từ các điểm dạng bông, lở loét cấy trên môi trường nghèo dinh dưỡng PDA, tiến hành phân lập, nuôi cấy và định danh tác nhân. Kết quả thu được, sau 72 giờ nuôi cấy trên môi trường PDA, ở nhiệt độ 250C, đã phân lập được một loài nấm là Saprolegnia sp.
3.3.2. Đặc điểm loài nấm Saprolegnia sp.
Dựa vào tài liệu phân loại của Alexopoulos (1962), với các đặc điển về khuẩn lạc, hình thái sợi nấm, bào tử, kết hợp với một số tài liệu nghiên cứu trước về loài nấm này, có hệ thống phân loại sau:
Hệ thống phân loại (Bruno và Wood, 1999): Ngành: Heterokonta Lớp: Oomycotea Bộ: Saprolegniales Họ: Saprolegniaceae Chi: Saprolegnia Loài: Saprolegnia sp.
Là loài nấm dạng sợi, thuộc nhóm bậc thấp, cấu tạo của nấm đa bào nhưng không có vách ngăn. Chiều dài sợi nấm từ 3 – 5mm, đường kính khoảng 20 – 40µm, hình ống có phân nhánh, và chia thành 2 phần, một phần gốc bám chắc vào cơ thể cá, phần ngọn tự do ngoài môi trường nước.
Nấm Saprolegnia sp. có khả năng sinh sản bằng nhiều hình thức khác nhau như: sinh sản dinh dưỡng bằng bào tử, sinh sản vô tính bằng túi bào tử kín, sinh sản hữu tính bằng tiếp hợp. Bào tử của nấm Saprolegnia sp. khi phóng ra ngoài môi trường di động nhờ tiêm mao nên gọi là động bào tử sơ cấp. Động bào tử sơ cấp tồn tại trong nước trong
A B C
Hình 3.13. Nấm Saprolegnia sp. phân lập từ cá tầm
A: Khuẩn lạc nấm trên môi trường PDA; B: Sợi nấm, túi bào tử được nhuộm xanh Malachite; C: Động bào tử thứ cấp.
khoảng thời gian vài phút rồi kết bào nang, nảy mầm phát triển thành động bào tử thứ cấp, thời gian tồn tại dài hơn so với động bào tử sơ cấp (Willoughby, 1994). Động bào tử thứ cấp được coi là bào tử lây nhiễm của Saprolegnia (Bruno và cs, 1999; Hatai và cs, 1994).
Saprolegnia phổ biến trong hệ sinh thái nước ngọt và là chi chính gây ra sự nhiễm bệnh do nấm trên trứng và cá nước ngọt. Trên cá, nấm Saprolegnia tấn công vào các mô biểu bì, thường bắt đầu ở phần đầu hoặc vây, sau đó lây lan trên toàn bộ bề mặt của cơ thể. Những biểu hiện bên ngoài của cá bị nhiễm Saprolegnia như nhìn bằng mắt thường có thể nhận thấy các cụm màu trắng xám dạng tròn của các sợi nấm, một dạng giống bông. Das và cs (2012) cho biết, cá bị nhiễm nấm Saprolegnia ngoài xuất hiện những đốm màu trắng – xám còn kèm theo xuất huyết trên da và vây của cá.
Cá bị nhiễm nấm Saprolegnia có hiện tượng bơi lội không định hướng do bị ngứa ngáy, làm cho cá hay cọ xát vào thành bể về hay các vật thể trong nước, gây nên những tổn thương bề mặt như xây xát, tạo điều kiện cho các tác nhân khác có cơ hội xâm nhập và gây bệnh.
Trên thế giới, đã có những báo cáo về thiệt hại do Saprolegnia spp. gây ra. Mỗi năm số cá hồi tại Nhật Bản chết trên 50% mà tác nhân là do loài nấm Saprolegnia parasitica (Bruno và Wood, 1999). Tại Chile, nước đứng thứ hai về sản xuất cá hồi, ở các
trang trại sản xuất giống, Saprolegnia sp. gây ung hư trứng từ khoảng 15 – 25% (Zaror, 2004).
Ở Việt Nam, bệnh do Saprolegnia spp. được biết đến và đặc trưng là bệnh nấm thủy my. Bệnh này bắt gặp khá phổ biến trên các đối tượng nước ngọt truyền thống như cá chép, cá mè, cá trắm cỏ,... Saprolegnia spp. gây thiệt hại đáng kể cho đối tượng nuôi từ giai đoạn giống đến thương phẩm. Bệnh thường bùng phát vào mùa đông xuân, mùa mưa khi nhiệt độ xuống thấp 18 – 250C. (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004).
3.3.3. Tần số bắt gặp nấm trên cá tầm giống ƣơng nuôi tại Lâm Đồng
Bảng 3.3. Tần số bắt gặp nấm trên cá tầm giống
Loài cá Nấm phân lập TSBG Tỷ lệ (%)