5. Những đóng góp mới của đề tài
2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Xác định loài sán lá gan lớn ký sinh ở trâu, bò tại một số huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên
2.3.2. Đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan lớn ở trâu, bò
2.3.2.1. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu và bò
- Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan ở các địa phương - Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan theo tuổi trâu, bò - Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan theo mùa vụ
- Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan theo tính biệt trâu, bò
2.3.2.2. Nghiên cứu về sự ô nhiễm trứng và ấu trùng sán lá gan ở ngoại cảnh và trong ký chủ trung gian
- Sự ô nhiễm trứng sán lá gan ở chuồng trại, bãi chăn thả
- Xác định loài ốc nước ngọt – ký chủ trung gian của sán lá gan Fasciola spp.
2.3.2.3. Nghiên cứu về thời gian sống của trứng sán lá gan lớn ở ngoại cảnh (khi chưa rơi vào môi trường nước)
- Thời gian sống của trứng sán lá gan trong phân trâu, bò - Thời gian sống của trứng sán lá gan trong đất
2.3.2.4. Nghiên cứu về thời gian Miracidium thoát vỏ và thời gian tồn tại của Miracidium trong nước
- Thời gian Miracidium thoát vỏ từ khi trứng rơi vào môi trường nước - Thời gian Miracidium tồn tại trong nước (khi không gặp ký chủ trung gian).
2.3.2.5. Nghiên cứu thời gian phát triển của ấu trùng sán lá gan trong ốc – ký chủ trung gian
- Thời gian hoàn thành các giai đoạn ấu trùng của sán lá gan trong ốc - ký chủ trung gian.
- Thời gian từ khi trứng sán lá gan rơi vào môi trường nước đến khi hình thành Adolescaria.
2.3.3. Đề xuất biện pháp phòng chống bệnh sán lá gan cho trâu bò ở tỉnh Thái Nguyên
- Xác định hiệu lực tẩy sán lá gan trâu, bò của 2 loại thuốc: Han-Dertil B và Bio - Alben.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp xác định loài sán lá gan lớn ký sinh ở trâu, bò tại một số huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên
- Mổ khám, thu thập sán lá gan ở ống dẫn mật trâu, bò. Định danh loài sán lá gan theo khóa định loại của Nguyễn Thị Lê (1996) [11], căn cứ vào đặc điểm hình thái, kích thước và cấu tạo của sán trưởng thành để xác định.
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan trâu, bò ở một số huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên
2.4.2.1. Quy định những yếu tố cần xác định liên quan đến tình hình nhiễm sán lá gan trâu, bò
* Tuổi trâu: Phân theo 4 lứa tuổi + Dưới 1 – 2 năm tuổi + 2 – 5 năm tuổi + 5 – 8 năm tuổi + Trên 8 năm tuổi
* Tuổi bò: Phân theo 4 lứa tuổi + Dưới 1– 2 năm tuổi + 2 – 5 năm tuổi + 5 – 8 năm tuổi + Trên 8 năm tuổi
* Mùa vụ: Mùa vụ trong năm được theo dõi gồm 4 mùa - Xuân : Tháng 2 - tháng 4;
- Hè : Tháng 5 - tháng 7; - Thu : Tháng 8 - tháng 10;
- Đông : Tháng 11 - tháng 1 năm sau.
2.4.2.2. Bố trí thu thập mẫu
- Thu thập mẫu theo phương pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc. Chọn 4 huyện trong tỉnh, mỗi huyện chọn 5 xã để lấy mẫu.
Mẫu được thu thập ngẫu nhiên tại các nông hộ, trang trại chăn nuôi trâu, bò tại 4 huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên.
- Các loại mẫu được xét nghiệm ngay trong ngày hoặc sau khi bảo quản
theo quy trình bảo quản mẫu trong nghiên cứu ký sinh trùng học.
Bảng 2.1: Sơ đồ bố trí thu thập mẫu
Loại mẫu Số lƣợng mẫu Số huyện/tỉnh Số xã/huyện
Mẫu phân 3.147 4 5
Mẫu nền chuồng 1.218 4 5
Mẫu đất bề mặt xung quanh
chuồng 1.218 4 5
Mẫu đất bề mặt bãi chăn 296 4 5
Mẫu nước đọng ở bãi chăn 274 4 5
Mẫu ốc nước ngọt 1.137 4 5
2.4.2.3. Phương pháp xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan * Phương pháp thu thập mẫu phân
- Thu nhập mẫu phân ngẫu nhiên ở trâu, bò nuôi tại nông hộ, trại tập thể và gia đình. Lấy phân trực tiếp từ trực tràng con vật. Để riêng mỗi mẫu vào một túi nilon nhỏ và mỗi túi đều có nhãn ghi: loại gia súc (trâu, bò), địa điểm, tuổi, trạng thái phân, thời gian lấy mẫu và các biểu hiện lâm sàng của trâu, bò. Ngoài ra, căn cứ vào những yếu tố cần xác định có liên quan đến đặc điểm dịch tễ để lấy mẫu cho tương đối đồng đều về các yếu tố khác.
* Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm sán lá gan
Xác định bằng phương pháp lắng cặn Benedek (1943)
Nguyên lý: lợi dụng tỷ trọng của trứng sán lá gan nặng hơn của nước lã nên trứng sẽ bị chìm xuống dưới.
Cách tiến hành: mỗi mẫu lấy một lượng phân khoảng 5 - 10 gam cho vào cốc thủy tinh sạch, cho khoảng 100 - 150 ml nước lã sạch vào, dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho tan phân, lọc qua lưới lọc (mắt lưới có đường kính 0,5 - 1
mm) vào một cốc thuỷ tinh khác. Bỏ cặn bã. Đổ thêm nước cho đầy cốc, để lắng cặn từ 15 - 20 phút, cẩn thận gạn nước trên đi, lấy cặn, cho thêm nước vào đầy cốc, để lắng. Lặp đi lặp lại nhiều lần cho đến khi nước trong, gạn phần nước trong phía trên đi, dùng công tơ gút hút cặn nhỏ lên phiến kính, soi dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần để tìm trứng sán lá gan. Những mẫu phân tìm thấy trứng sán lá gan được xác định là có nhiễm, ngược lại là không nhiễm.
* Phương pháp xác định cường độ nhiễm sán lá gan
Xác định cường độ nhiễm sán lá gan bằng phương pháp đếm trứng Mc. Master (đếm số trứng/gam phân trên buồng đếm Mc.Master theo tài liệu của Jorgen Hansen và cs (1994) [47]).
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu trứng và ấu trùng sán lá gan ở ngoại cảnh và ký chủ trung gian
2.4.3.1. Phương pháp nghiên cứu sự ô nhiễm trứng sán lá gan ở chuồng và khu vực xung quanh chuồng nuôi trâu, bò
* Phương pháp thu thập mẫu
- Mẫu đất hoặc cặn nền chuồng trâu, bò: Tại mỗi ô chuồng, lấy mẫu đất (cặn) ở 4 góc chuồng và ở giữa chuồng, trộn đều được một mẫu xét nghiệm (khoảng 80 – 100g/mẫu). Mỗi mẫu được để riêng trong túi nilon, có nhãn ghi địa điểm và thời gian lấy mẫu.
- Mẫu đất bề mặt xung quanh chuồng nuôi: Lấy mẫu đất bề mặt tương tự như cách lấy mẫu cặn nền chuồng.
* Phương pháp xét nghiệm mẫu
Xét nghiệm bằng phương pháp lắng cặn Benedek để phát hiện trứng sán lá gan.
2.4.3.2. Phương pháp nghiên cứu sự ô nhiễm trứng sán lá gan ở khu vực bãi chăn thả
* Phương pháp thu thập mẫu ở khu vực bãi chăn thả trâu, bò
- Mẫu đất bề mặt ở khu vực bãi chăn thả trâu, bò: Tại mỗi khu vực chăn thả, cứ khoảng 20 – 30 m2
lấy ngẫu nhiên ở vị trí 4 góc và ở giữa, trộn đều được một mẫu xét nghiệm, khối lượng khoảng 80 – 100g/mẫu. Mỗi mẫu được để riêng trong túi nilon, có nhãn ghi địa điểm và thời gian lấy mẫu.
Mẫu nước ở những chỗ trũng trên khu vực bãi chăn thả: Dùng que
khuấy đều nước, lấy cốc thủy tinh múc khoảng 400 - 500 ml/ vũng, mỗi mẫu
để riêng trong một túi nilon có nhãn ghi địa điểm và thời gian lấy mẫu
* Phương pháp xét nghiệm mẫu
Xét nghiệm mẫu bằng phương pháp lắng cặn Benedek để phát hiện trứng sán lá gan.
2.4.3.3. Phương pháp xác định loài ốc nước ngọt – ký chủ trung gian của sán lá gan Fasciola spp
Thu thập mẫu ốc (ốc không có nắp miệng): Bắt ốc ở ruộng lúa, mương nước, ao, ao rau muống, các khe nước nhỏ, vũng nước nhỏ trong khu vực chăn thả trâu, bò. Ốc thu được để trong hộp nhựa chứa nước và các cây cỏ thuỷ sinh tại nơi bắt ốc, có nhãn ghi địa điểm và thời gian thu thập mẫu.
* Định loại theo khóa định loại của Đặng Ngọc Thanh và cs (1980) [25]. * Xác định mật độ ốc - ký chủ trung gian ở các mùa: bắt và đếm số lượng ốc trong 1 m2 ao rau muống, ruộng lúa,…sau đó tính bình quân để xác định mật độ ốc bình quân/m2
ao hoặc ruộng lúa.
* Gây nhiễm ấu trùng sán lá Fasciola cho loài ốc đã định loại để xác định chúng có phải là ký chủ trung gian của sán Fasciola hay không?
2.4.3.4.Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá gan của ốc nước ngọt
Xác định tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá gan của ốc nước ngọt: sử dụng 2 lam kính sạch, đặt ốc vào giữa 2 lam kính, dùng tay ép nhẹ 2 lam kính đến khi vỏ ốc vỡ và ốc nát ra. Đưa lam kính kiểm tra dưới kính hiển vi để phát hiện các dạng ấu trùng sán lá gan và xác định loài theo khóa định loại ấu trùng của Ghinhecinskaja T. A. (1968).
Chú ý: dùng công tơ gút nhỏ 1 giọt nước sạch vào mẫu ốc vừa ép để mẫu không bị khô và kiểm tra dưới kính hiển vi dễ dàng hơn.
2.4.4. Nghiên cứu thời gian sống của trứng sán lá gan ở ngoại cảnh (khi không rơi vào môi trường nước)
- Nghiên cứu thời gian sống của trứng sán lá gan trong phân trâu, bò
* Thí nghiệm 1: Theo dõi thời gian sống của trứng sán lá gan trong phân trâu, bò (trường hợp trứng sán lưu cữu trong phân)
- Lô 1: gồm 5 mẫu, các mẫu là hỗn hợp phân của một số trâu, bò bị nhiễm sán lá gan nặng. Mỗi mẫu được đặt vào một chậu thủy tinh tròn có đường kính 30 cm, cao 20 cm, dán nhãn ghi ngày, tháng bắt đầu thí nghiệm, để mẫu ở điều kiện nhiệt độ và ẩm độ không khí bình thường.
- Lô 2: bố trí như lô 1, chỉ khác là các mẫu phân luôn được duy trì trong trạng thái ẩm ướt.
Hàng ngày kiểm tra trạng thái ẩm ướt của các mẫu phân bằng phương pháp cảm quan và dùng bình phun sương bổ sung nước để duy trì độ ẩm cần thiết ở lô II. Mỗi ngày lấy 4 - 5 gam phân từ mỗi mẫu, xét nghiệm phân bằng phương pháp lắng cặn Benedek để tìm trứng sán lá gan.
Xác định thời gian tồn tại của trứng trong phân bằng cách kiểm tra hình thái của trứng, vỏ trứng, phôi bào bên trong trứng sán lá gan, xem chúng có biến đổi gì khác so với trứng sán lá gan bình thường hay không? Sau đó,
những trứng có biến đổi màu sắc, phôi bào bị phân hủy được cho vào cốc thuỷ tinh chứa nước để theo dõi xem trứng đó khi vào môi trường nước có phát triển được hay không? Nếu trứng bị biến đổi khi quan sát dưới kính hiển vi: phôi bào dung giải, vỏ trứng nhăn nheo, hoặc phôi bào đen lại…, đồng thời khi cho vào môi trường nước trứng không nở được thành mao ấu thì những trứng này đã bị chết. Từ đó có thể xác định được thời gian tồn tại của trứng trong phân trâu, bò.
Thí nghiệm được bố trí trong 2 mùa: mùa thu và mùa đông.
- Nghiên cứu thời gian sống của trứng sán lá gan trong đất
Phương pháp xác định và duy trì độ ẩm đất: Xác định độ ẩm của đất trước khi thí nghiệm theo tài liệu của Lê Văn Khoa và cs (1996) [11]. Độ ẩm của đất trước khi thí nghiệm được xác định bằng cách: lấy 100 gam đất, sấy ở 105°C cho đến khi khối lượng giữa các lần cân không đổi thì dừng lại và tính ẩm độ theo công thức:
Wt (%) = (a/b) x 100 Trong đó:
a: Lượng nước mất sau khi sấy b: Khối lượng đất trước khi sấy Wt: Độ ẩm của đất (%)
Hàng ngày, kiểm tra độ ẩm đất của mỗi lô thí nghiệm bằng phương pháp cảm quan. Duy trì độ ẩm như vậy trong suốt thời gian thí nghiệm (dùng bình phun sương bổ sung nước để duy trì độ ẩm cần thiết).
* Thí nghiệm 2: Theo dõi thời gian sống của trứng sán lá gan trong lớp đất bề mặt (trường hợp trứng sán lá gan phát tán ra đất, chưa rơi vào môi trường nước)
Cho đất ở 4 độ ẩm (< 10%; 10 - 20%; 20 - 30%; 30 - 40%) vào 8 khay (đất ở mỗi độ ẩm được bố trí trong 2 khay, kích thước 30 x 20 x 5 cm). Lớp
đất dày khoảng 3 - 4 cm. Trộn đều một số lượng lớn trứng sán lá gan với lớp đất bề mặt ở mỗi khay. Duy trì độ ẩm đất cần thiết theo từng lô thí nghiệm:
Lô I: Đất có ẩm độ < 10%. Lô II: Đất có ẩm độ 10% - 20%. Lô III: Đất có ẩm độ 20% - 30%. Lô IV: Đất có ẩm độ 30% - 40%.
Mỗi ngày lấy 4 - 5 gam đất bề mặt trong mỗi lô, xét nghiệm bằng phương pháp lắng cặn 2 bước/lần để tìm trứng sán lá gan:
Bước 1: cho đất vào cốc thủy tinh, đổ nước vào khuấy tan đất. Sau 5
phút gạn sang cốc khác, bỏ cặn.
Bước 2: để nước lọc lắng 20 - 30 phút, gạn nước trên, giữ lại cặn, tiếp tục như vậy vài lần. Khi nước đã trong thì gạn bỏ nước, giữ lại cặn để kiểm tra dưới kính hiển vi. Từ đó tìm được trứng sán lá gan trong các mẫu đất.
Xác định thời gian tồn tại của trứng sán lá gan trong đất ở các độ ẩm khác nhau bằng cách: kiểm tra hình thái của trứng, vỏ trứng, phôi bào bên trong trứng sán lá gan. Sau đó, số trứng này được cho vào cốc thuỷ tinh chứa nước để theo dõi xem trứng đó khi rơi vào môi trường nước có phát triển được hay không? Nếu trứng bị biến đổi khi quan sát dưới kính hiển vi: phôi bào dung giải, vỏ trứng nhăn nheo, hoặc phôi bào đen lại…, đồng thời khi cho vào môi trường nước trứng không nở được thành mao ấu thì những trứng này đã bị chết. Từ đó xác định được thời gian tồn tại của trứng sán lá gan trong đất.
Thí nghiệm được bố trí trong 2 mùa: mùa thu và mùa đông.
2.4.5. Nghiên cứu thời gian thoát vỏ và thời gian sống của Miracidium trong nước
- Nghiên cứu thời gian Miracidium thoát vỏ trong nước
Bố trí thí nghiệm gồm 3 lô (I, II, III), mỗi lô gồm 10 đĩa petri đường kính 20 cm, cao 3 cm (có dán nhãn ghi thời gian bắt đầu thí nghiệm) chứa gần đầy nước thu thập từ các khu vực chăn thả trâu, bò. Xác định pH của nước (bằng giấy quỳ). Cho số lượng lớn trứng sán lá gan vào mỗi đĩa petri.
Hàng ngày, khuấy đều và dùng công tơ gút hút nước có trứng sán lá gan ở mỗi đĩa petri đặt trên phiến kính (mỗi mẫu lấy khoảng 20 - 30 trứng), soi dưới kính hiển vi để theo dõi sự phát triển của trứng sán lá gan và xác định thời gian Miracidium thoát vỏ trong nước từ khi trứng rơi vào môi trường nước.
Thí nghiệm này, chúng tôi theo dõi sự phát triển của trứng sán lá F. gigantica và thấy rằng từ khi trứng rơi vào môi trường nước tới khi trứng nở thành Miracidium thì trứng đều phát triển qua 9 giai đoạn.
Các giai đoạn phát triển của trứng sán lá F. gigantica như sau:
Giai đoạn 1: phôi trứng có 1 tế bào, nằm gần phía nắp của vỏ trứng (trứng ngày thứ nhất).
Giai đoạn 2: phôi trứng bắt đầu phân chia, phôi vẫn nằm ở vị trí gần nắp vỏ trứng (trứng ngày thứ 2).
Giai đoạn 3: phôi tăng kích thước và phân chia thành nhiều tế bào sắp xếp thành hình quả bóng, phôi vẫn nằm ở vị trí gần nắp vỏ trứng (trứng ngày thứ 3).
Giai đoạn 4: phôi di chuyển tới trung tâm trứng, có hình ovan. Số lượng tế bào noãn hoàng giảm dần và dễ trông thấy (trứng ngày thứ 4).
Giai đoạn 5: phôi phát triển bằng 1/2 chiều dài trứng, kéo dài ra, nằm ở trung tâm trứng và được bao quanh bởi một số tế bào noãn hoàng (trứng ngày thứ 5).
Giai đoạn 6: phôi bắt đầu nhìn giống Miracidium. Phần cơ thể bắt đầu phát triển kéo dài và lớn dần về phía trước, nhỏ dần về phía sau. Nhiều tế bào noãn hoàng biến mất dành khoảng không gian cho Miracidium (trứng ngày thứ 6).
Giai đoạn 7: phôi phát triển nhìn giống Miracidium. Hai điểm mắt đã bắt
